Thermo Easy nLC method 설정 방법

Easy nL 시리즈는 사용자가  프로테오믹스 분석하는데 있어서  쉽게 사용할수 있도록 디자인 되어 있습니다.  특별히 nano LC에 대해서 잘 알지 못하더라도 쉽게 사용할수 있습니다.  일반 LC와는 다르게 nano LC의 경우  시료를 주입후 질량분석기의 분석이 시작되는 전까지 과정에서 특별한 주의가  필요합니다. 하지만 이 장비는 그 과정을 자체적으로 제어할 수 있게 되어 있습니다.  또한 터치 스크린이라서 장비화면에서도 조작이 가능합니다.  하지만 쉽게 사용할수 있다는 장점과 더불어 다른 LC 장비에 비해서는 modification이 허용되지 않는 단점이 있습니다.  다양한 application에서는 사용하기가 어렵습니다.

 

일단 Method를 설정하는 방법을 알아보겠습니다.

 

Trap-Column 사용여부에 따른 설정

이 장비는 trap-column을 사용하는 방법과  trap-column이 없이  바로 analytical column에 주입하는 방법 이 있습니다. 두 방법에 따라서 장비가 자동으로 설정이 됩니다.   Trap-column컬럼을 사용여부를 아래의 화면에서 설정하면 됩니다.  아래와 같이 Maintenance->Device->Easy nLC-> Properties에서  On-column setup에서 설정을 바꿀수 있습니다.

체크가 되면 Trap-column이 없는 상태가 됩니다.

 

Trap-column 사용시

 

 

Trap-column 미사용시

 

아래와 같이 on-column setup 일때 스크린 화면에서 trap-column 모양이 사라집니다.

 

 

 

Sample Pickup

 

Sample Pickup: 주입할 시료의 volume을 적습니다. 하지만  여기에 적는 값은 실제 실험과 무관합니다. Xcalibur의 seqeunce에서 적는 injection volume값을 우선하기 때문입니다. 아무 숫자나 넣으면 됩니다.  단 sample Loop  volume에서 -2 값까지 허용됩니다.

 

Flow : 시료를 주입할때 어느정도의 속도로 시료를 pick-up할것인가 입니다.

유속이 적을수록 더 정밀하겠지만 특별히 큰 차이는 없는것 같습니다. 보통 10 µL/min으로 합니다. 즉 1µL 주입하는데 약 1분이 소요됩니다.

 

 

 

Sample loading

 

Volume : 시료가 trap-column 혹은 analytical columm (one-column setup)에 주입된후 washing 이 되는데 소요되는  volume입니다. 그러므로 주입된  시료의 양 (volume)보다 많은 양이 되어야 하며 보통 3배 이상을 되어야 합니다.   

 

Trap-column이 있을 경우는 trap-column으로 loading이 된다는 의미있습니다.

Trap-column이  없을 경우 (on-column setup)에서는 analytical column 에 loading이 된다는 의미있습니다.

 

여기서 설정한 volume 소모하는데 있어서 두 가지 방법이 있습니다.  

Flow:  원하는 flow-rate를 입력하면 해당 flow-rate으로 설정한 volume 만큼 용매가 흐르게 됩니다.  예를들면 Volume 이 10 µL이고  flow가 10 µL/min이면 약 1분이 소용됩니다. 이때 Max.Pressure는 최대 허용할수 있는 압력입니다. 이것은 nano LC에서 종종 생기는 고압력으로 인해 시스템에 손상이 되는것을 방지 합니다.   원하는 flow-rate에 도달하기 전에 max.pressure에  도달하게 되면 더 이상 flow-rate이 올라가지 않고 max.pressure에 해당하는 flow-rate으로 진행됩니다.  그렇지 않으면 시스템의 한계 압력까지 올라가서 결국 시스템에 문제가 생길수 있습니다.  예를 들면 flow 가 10ul/min이고 Max. pressure가 600 bar 일때 , flow-rate이 증가하는 도중 5 µL/min에서 Max.Pressure인 600bar에 도달하게 되면 더 이상 flow-rate이 올라가지 않고 그 상태에서 sample loading이 진행됩니다. 보통 컬럼이 견딜수 있는 압력의 60~70%까지 설정하면 됩니다.

 

Max.Pressure : Max. Pressure 만으로 제어하기 위해서는 flow를 빈칸으로 두어야 합니다. 그러면 flow-rate에는 상관없이 설정한 Max.pressure까지 압력이 올라가도록 flow-rate를 조절합니다.  즉 이것은 컬럼의 backpressure에 따라 달라집니다.  즉  컬럼의 backpressure에 따라 600 bar에서 10 µL/min가 될수도 있고 5ul/min도 될수 있습니다. 일반적으로 Max.Pressure 옵션을 설정합니다. 

 

여기서 trap-column이 있는 경우와 없는 경우가 차이가 납니다.

Trap-column 은 상대적으로  낮은 backpressure 가 유지되지만 analytical column (one-column setup) 은 상대적으로 높은 압력이 유지됩니다. 또한 trap-column 은 volume이 크고 analytical column은 작습니다.

이러한 이유로 서로 다른 값을 사용하는게 좋습니다.

 

일단 Trap-column은 압력이 낮기 때문에 Volume  값을 충분히 큰 값으로 적어도 됩니다. 보통 시료를 5ul이내에서 하기 때문에 Volume 은 5~20 µL사이에 합니다.  Max.Pressure를 600 bar로 하면 보통 flow-rate는 5 µL/min ~10 µL/min이 됩니다. 즉 Volume 값을 20 µL로 설정하더라도 2~5분이면 충분히 완료됩니다. 

 

One-column setup에서는 이와 같은 셋팅을 하게 되면 문제가 생길수 있습니다. 일단 압력이 높기 때문에  해당 flow-rate 이 낮아지게 됩니다.  예를 들면 Volume 20 µL, Max. Pressure 600 bar로 설정했을 경우, 25 cm analytical column의 flow-rate은 보통 500~700 nL/min가 됩니다. 계산해보면 20 ul로  washing하기 위해서는 약 30분 이상이 소요 됩니다. 이러한 이유로   One-column setup에서는 최대한 적은 volume 의 시료를 주입하고 Volume   값도 최소로 합니다. 즉 1 µL 시료를 주입하고 volume값을 3 ul 정도로 설정합니다.

 

 

 

Gradient

 

Gradient 는 시료분석의 목적에 따라 적절하게  만듭니다.  보통의 nano LC 의 경우 분석이 마지막 단계에서는 Buffer A와 B의 조성이 분석 초기 조건으로 바뀌어서 다음 분석을 준비할 수 있게 합니다 (Column Equilibrium)

하지만 Easy nLC의 경우 Column Equilibrium이 시료주입전에 진행됩니다. 그러므로 LC Gradient에서는 이러한 Column Equilibrium을 따로 설정하지 않습니다.

 

 

Pre-Column  Equilibration

 

Pre-Column  Equilibration은 Trap-column을 사용시에만 필요합니다. 시료가 trap-column으로 주입되기 전에 충분히 Equilibrium을 시켜야 됩니다. 그렇지 않으면 않으면 펩타이드가 결합하지 않습니다. 이러한 이유로 Buffer A로 정해진 volume만큼 흘려줍니다. Trap-column의 크기에 따라 다르지만 보통 10ul이면 충분합니다. 여기서도 flow-rate 과 Max.pressure로 조절할수 있습니다. One-column setup에서는 Pre-column Enquiliration에서 숫자가 입력되어 있더라도 이 과정을 거치지 않습니다. 

 

 

Analytical column equilibration

 

시료분석전에 Analytical column을 equilibrium 과정을 거칩니다. 보통 25 cm 길이의 컬럼은 3~5ul 이면 충분합니다. 여기서도 flow-rate 과 Max.pressure로 조절할수 있습니다.

 

Autosampler

 

Auto-sampler Wash

시료주입후  needler과 sample loop를 세척하여 다음시료 주입시 carry-over가 생기지 않게 합니다.  먼저 유기용매의 함량이 많은 buffer로 세척을 한후 다시 Buffer A와 같은 수용성 buffer로 equilibrium 시킵니다. sample loop + 8 µL까지 가능하므로 20 µL sample loop의 경우 28 µL까지 가능합니다. 이 과정은 시료가 주입되고 질량분석기가 시료를 분석하는 과정에서 수행하기 때문에 추가적인 시간이 소요되지 않습니다. 이 과정에서는 injection needle이 움직이기 때문에서 Sample tray 문이 열리지 않도록 되어 있습니다. 아래 그림은 Bottle 2 위치에 유기용매를 넣고 Bottle 3에 Buffer A를  넣은후 각각 한번씩 Washing 하는 과정입니다.