In-source fragmentation (CID) for N-linked peptide Characterization

앞에서  In-source fragmentation 에 대한 설명을 하였습니다. 이번에는  In-source fragmentation 을  N-linked glycopeptide 분석하는데 있어서 어떻게 적용할수 있는지 알아보겠습니다.  

 

이전에 사용했던 mAb 의 EEQYNSTYR에 결합된 N-linked glycopeptide을 이용하여 분석하였습니다.

 

관련글]  Monoclonal Antibody (mAb)에서 Intact N-linked glycopeptides 분석

 

Peptide Backbone Peak in N-linked glycopeptide fragments

이전 글에서 보듯이 EEQYNSTYR backbone에 다양한 glycan이 붙어 있습니다. 그리고 그들의 MS2 스펙트럼에는  backbone에 해당하는 EEQYNSTYR (m/z  1189.5162, 1+) 이 검출됩니다.

 

 

In-Source fragmentation of  N-linked glycopeptides

In-source fragmentation를 이용하여  Intact N-linked glycopeptide에 떨어진 backbone peptide (EEQYNSTYR)를 다시 MS2 로 fragmentation 할수 있습니다.    아래 스펙트럼은 동일한 시료를 In-source fragmentation을 사용한것과 하지 않았을 때에 backbone peptide (EEQYNSTYR)의 검출여부를 보여줍니다.

 

 

먼저 No In-source fragmentation에서는 EEQYNSTYR 피크가 9.6분에서  검출되었습니다. EEQYNSTYR 는 glycosylation된 형태로 존재하기는 하지만  일부분은 glycosylation이 되지 않은 상태이기 때문에 intact backbone 펩타이드가 검출이 되었습니다.

 

In-source fragmentation을 수행하였을때  약간 더 이른 시간에  EEQYNSTYR 에 해당하는 두 피크인 m/z 595.2596 (2+)  와  m/z 1189.5125 (1+) 가 8.6분에서 검출이 되었습니다. 이것은 원래 N-linked glycopeptide 형태로 있었기 때문에  C18컬럼에서 EEQYNSTYR 과 분리됩니다. 그리고  먼저 컬럼에서 용리된후  In-source fragmentation 으로 인해 N-linked glycan이 떨어지게 됩니다.  여기서 완전히  fragmentation되지 않고 남은 Intact backbone 펩타이드도 검출이 됩니다. 

 

이렇게 intact N-linked glycopeptide에 떨어진 backbone 펩타이드와 와 intact backbone 펩타이드는 동일하지만 다른 시간대에 용리됩니다.  

 

 

MS2 fragmentation of a peptide backbone in an In-source fragmentation

In-Source fragmentation에서 검출된 intact 펩타이드를 MS2를 수행하였지만 아쉽게도 좋은 결과를 얻지 못했습니다.

아마  충분히 많은 양의 이온이 생성되지 않았기 때문일것 같습니다. 최적화가 되면 좋은 결과를 얻을수 있을 것 같습니다.

 

 

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