Exploris 480 장비에서 Easy-IC를 이용한 internal calibration의 효율성

측정되는 펩타이드이 m/z값의 accuracy를 높이기 위해서 Acquisition 과정에서 Lock mass 방법을 사용합니다. Background 에서 항상 등장하는 대표적인 피크인 Polysiloxane 의 여러 형태인 m/z 371.101236 와 m/z 445.12003 를 사용합니다. 선택한 m/z에 따라 질량분석기는 이 피크를 선택적으로 m/z값을 선택하여 측정한후 전체 스펙트럼의 m/z값을 보정합니다. 이 방법을 사용하면 장비의 accuracy가 떨어지더라도 10ppm 이내로 보정이 가능합니다. 또한 실시간으로 스캔하여 측정하는데 소요되는 시간은 아무 미비하여 펩타이드를 분석하는데 거의 영향을 주지 않습니다. 하지만 이 두 피크는 LC gradient에 따라 감도가 다르고 종종 background에서 잘 나오지 않을때가 있습니다.

Orbitrap 시리즈에 Easy-IC source를 옵션으로 장착할수 있습니다. ETD에서 사용되는 Fluoranthene reagent anions(m/z 202) 등으로 internal calibration 을 수행할 수 있습니다. Easy-IC는 아마 이러한 단점을 보완할수 있을 것같습니다. 장비 source 부분에서 지속적으로 적당량의 Internal Calibrant 주입되기 때문입니다. 또한 펩타이드들이 이미 이온화가 된 후 Source 로 들어간 상태에서 혼합되기 때문에 ion suppression 현상도 없을것이라 예상됩니다.

The spectrum of the ETD reagent anion (m/z 202, profile mode)

Easy-IC에 의한 calibration은 두가지 방법이 있습니다. 첫번째는 모든 scan 마다 internal calibration solution의 m/z값을 측정하여 전체를 보정하는것입니다(Easy-IC). 다른 하나는 분석 초기에 측정한 값으로 나머지 분석에 적용하는것 입니다(RunStart Easy-IC). Orbitrap의 경우 질량분석기 내에서 scan 와 detection이 거의 실시간으로 동시에 이루어지기 때문에 internal calibration의 과정이 첨가되더라도 특별히 분석속도에는 영향이 없습니다.

DDA Assay

각각의 방법에 HeLa standard를 이용하여 DDA 분석을 보았습니다.아래는 검출된 단백질과 펩타이드의 수입니다.

검출되는 수에는 큰 차이가 없지만 Easy-IC 방법에서는 Runstart Easy-IC 이 조금 나은것 같습니다. 기존의 방법인 background 피크를 이용하는 방법과는 큰 차이가 없는 것같습니다. 아래는 각 방법에서 얻어진 펩타이드들의 ppm accuracy 분포도입니다. 유사한 분포도를 보입니다. Easy-IC에서 보다 조금 더 높은 accuracy를 보입니다. 아마 모든 scan에서 calibration을 수행하기 때문일것이라 생각합니다.

PRM Assay

DDA 방법인 아닌 PRM 분석에서도 비교해보았습니다. 이번에는 calibration을 하지 않은것과 m/z 371.10123 을 추가하였습니다. 펩타이드 종류에 따라 결과값이 다르긴 하지만 두가지 Easy-IC 방법이 User defined Lock mass 에 비해는 감도는 약간 떨어집니다. 즉 PRM에서는 Easy-IC internal calibration이 큰 효과가 없는것 같습니다.

앞에 글에서 EncyclopeDIA 분석법에 대해서 설명을 하였습니다. 동일한 시점에서 동일한 시료/장비를 이용하여 Overlap DIA, non-Overlap DIA, 그리고 DDA (LFQ)의 결과를 비교하였습니다. Overlap DIA로 분석한..