N-terminal glutamine (Q) 과 glutamic acid (E)의 pyroglutamate Modification

 

N-terminal pyroglutamate(pE) 형태는 일반적으로 monoclonal antibodies의 공정에서나 혹은 저장과정에서 자주 발생하는 PTM중 하나입니다. N-terminal glutamine (Q) 과 glutamic acid (E) 가 pyroglutamate 형태로 바뀌게 됩니다.  이 과정에서 분자량은 아래와 같이 줄어들게 됩니다. 일반적인 PTM 의 경우 분자량이 증가하지만 이것은 감소합니다.  

Glu(E)->pyro-Glu : -18.0153 Da

Gln(Q)->Pyro-Glu : -17.0265 Da

 

Proteome Discoverer에서 N-terminal pyroglutamate modification 설정

Proteome Discoverer에서는 해당 PTM이 존재함으로 검색시 추가하면 됩니다. 만약 보이지 않는다면 아래와 같이 

Chemical Modification 에서 Glu->Pry-Glu, Gln->pyro-Glu 를 체크하고 Apply를 누르면 됩니다.

 

아래와 같이 보이게 됩니다.

  

N-terminal pyroglutamate modification 검출하기 

테스트를 위해서  시중에 판매되는 Waters 사의 mAb tryptic digestion(P/N 186009123) 을 이용하여 분석해 보았습니다. Heavy chain 의 N-terminal 의 tryptic peptide는 QVTLR 입니다. 여기서 Glutamine (Q)은 pyroglutamat 형태로 되어 있습니다. 

 

QVTLR의 이론적인 m/z 는 308.6925(2+) 이며 pQVTLR의 m/z 300.1792 (2+)입니다. 

아래는 각 펩타이드의 이론적인 fragment ion 테이블입니다. 

 

 

100ng의 mAb tryptic peptdie standard에 대한 크로마토그램입니다. 

 

 

각각의 펩타이드에 해당하는 precursor ion은 아주 낮은 감도도 검출이 되었습니다. 아래는 pQVTLR 의 Precusor ion peak 입니다.

 

 

 

높은 감도를 위해 PRM을 수행하여 Skyline으로 분석하였습니다.  Precursor ion의 감도는 낮지만 PRM의 높은 감도로 인해 좋은 MS2 스펙트럼을 얻을수 있었습니다. 아래와 같이 두 펩타이드가 잘 검출되었습니다.

 

N-terminal에 modification이 되어있기 때문에 두 펩타이드의 y ion 시리즈는 거의 일치하지만 b ion 시리즈는 다르게 됩니다. 즉 PTM 여부를 정확히 확인하기 위해서는 b ion 시리즈의 검출여부를 확인해야 합니다. 

 

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