Low Load µPAC Neo Column, 3,300 proteins with 1ngHeLa DIA

Sing-cell Proteomics가 많이 발전하고 있는것 같습니다. 개인적으로는 아직까지 시도해볼 생각은 없습니다. 하지만 극소량의 시료를 분석할수 있는 플랫폼을 만들 필요는 있는것 같습니다. 

 

최근에 µPAC Neo 컬럼 시리즈중에 Low loading uPAC Neo컬럼을 구매해서 테스트를 해보았습니다.. 연구소에도 소량의 단백질 분석에 대한 문의가 몇번 있었습니다.  개인적생각으로는  극미량을 분석할수있는 LC-MS/MS분석법을 개발하는것보다는 시료의 양을 많이 확보할수 있는 방법을 찾는것이 더 나은 방법인것 같습니다. 이것은  질량분석기가 없이 실험실 벤치에서도 충분히 할수 있는 작업입니다. 하지만 시료의 양을 증가시킬수 없을 경우를 대비해서 플랫폼이 필요할듯합니다.

 

아무튼 이번에도 1ngHeLa standard를 이용하여  테스트를 해보았습니다. 앞에서도 계속 이야기하는것이지만 µPAC 컬럼의 분리능은 기존의 컬럼과 TIP이 일체형에 비해서 좋지 않는것 같습니다. 컬럼과 Tip사이의 tubing 때문입니다.

 

 

1ngHeLa를 이용하여  기존의 사용컬럼과 Low loading µPAC 컬럼의 성능을 비교해보았습니다.

• Orbitrap Eclipse+FAIMS (OTIT)
• Vanquish Neo

 

아래는 이전의 packing 컬럼으로 분석했던 결과입니다 1ng HeLa에서  Orbitrap Eclise(FAIMS, OTIT DDA)로  약 2000개의 단백질을 검출하였습니다.

 

아래는 기존의 packing column과 low load µPAC에서 얻은 200ngHeLa 크로마토그램입니다.    µPAC 컬럼의 경우 300nL보다는 250nL에서 좋은 크로마토그램을 얻었습니다. 하지만 피크의 모양은 여전히 기존의 상용컬럼이 더 좋아 보입니다.

 

 

 

 

하지만 예상과는 다르게 단백질/펩타이드 검출수는 uPAC컬럼이 약간 더 높습니다.  비슷하거나 약간만 적어도 만족할려고 했는데 오히려 높은 숫자를 얻었습니다.

 

사실 더 중요한것은 정량분석입니다. 그래서 이번에는 1ng HeLa standard를 이용하여 DIA 분석을 해보았습니다.  논문을 검색하다 보니 이미 발표된 자료가 있었습니다.

 

해당 raw files을 다운받아서 동일한 파마미터를 사용해 보았습니다. 

 

 

아래는 1ngHeLa를 120min LC gradient로 DIA를 분석한 결과입니다. 기존에 실험실에서 사용했던 방법, 논문에서 몇가지 사용했던 방법, 그리고 논문의 방법에서 조금 최적화한 방법입니다.  논문의 방법에서 제가 조금 조절한것에서 약 3,200개의 단백질이 정량분석이 되었습니다.  생각보다 좋은 결과를 얻었습니다. DIA 분석법으로 1ng HeLa stad에서 3,000개 이상의 단백질을 검출할수 있으니 괜찮은것 같습니다..

 

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