30 min DIA with 50 cm µPAC Neo column

DIA 분석 방법의 시간 단축을 위한 최적화

현재 실험에서는 약 8,000개의 단백질이 안정적으로 검출되고 있어, 단백질 수를 더 늘릴 필요성은 크지 않습니다. 그러나 앞으로 대량의 샘플을 분석해야 하는 프로젝트가 논의되고 있는 상황에서, 분석 시간을 단축하는 방향으로 DIA 분석법을 최적화할 필요가 생겼습니다. 특히, 단백질 수가 다소 줄더라도 짧은 LC 시간을 통해 효율적인 분석을 구현하는 것이 목표입니다. 요즘 장비 (TimsTOF or Astral)의 경우 매우 짧은 시간으로 분석이 가능하지만 Exploris480이나 Eclipse의 경우 아직은 한계가 있습니다.

 

대량 시료 분석의 어려움

기존의 컬럼으로 많은 시료를 분석할 때 다음과 같은 어려움이 발생합니다.

1. 긴 분석 시간
2. 컬럼의 막힘 현상

특히 Vanquish Neo LC에서 direct injection mode를 사용할 경우, 시료가 주입되는 시간만 해도 상당한 시간이 소요됩니다. 이를 해결하기 위해 컬럼 막힘 현상을 최소화하고, 분석 외 소요 시간(예: 시료 주입 시간) 을 줄이는것이 필요합니다.

 

이전에 Premier LC/MS 컬럼을 사용한 내용입니다.

Premier LC/MS 컬럼 테스트 리뷰

Premier LC/MS Columns

 

50 cm µPAC Neo 컬럼 사용

이러한 이유로, 최근에 50 cm µPAC Neo 컬럼을 다시 테스트하였습니다. 이 실험은 이전에 테스트했던 Premier LC/MS 컬럼과 연장선상에 있습니다. 이전에 50 cm Neo 컬럼을 사용했을 때는 피크 형태가 만족스럽지 않아 중단했지만 (https://proteomicstechnology.tistory.com/524) 다시 사용해본 결과 기존에 사용하던 CoAnn 컬럼과 거의 유사한 결과를 보였습니다.

 

120 min DIA ( CoAnn & 50 cm µPAC Neo)

 

분석 조건

• 분석 방법: DIA
• LC Time: 120 min
• 샘플: 200 ng HeLa Digest
• 기기 설정: FAIMS mode 사용
• 소프트웨어: Spectronaut

 

30, 60, 120min DIA with  50 cm µPAC Neo µPAC Neo 컬럼의 경우 Vanquish Neo LC의 Column comparment에 넣고 heating(50c)을 할 경우 높은 유속(1 µLL ~ 2 µL)으로 시료를 loading 할수 있습니다. 그래서 분석시간이 더 줄어듭니다.

 

 

 

최종적으로, 다음과 같은 결과를 얻었습니다

 

 

•Although the 30-minute DIA method achieved only 60% of the peptide identifications compared to the 120-minute method, the number of quantified proteins was very similar between the two. 

•By sacrificing peptide coverage, the 30-minute method allows for a 75% reduction in instrument time while still maintaining comparable protein identification numbers. 

•For future experiments, the 30-minute DIA method will be further optimized to maximize peptide identification. 

•The 30-minute DIA method offers a valuable advantage for analyzing large sample sets by reducing total run time and minimizing technical bias that may arise from extended LC gradients.