프로테오믹스(단백체학)361 Proteome Discoverer 3.0에 CHIMERYS 설치 완료 11월 중순인데 미시간에는 벌써 눈이 엄청오기 시작했습니다. 아이들 학교도 닫았고 저도 그냥 집에서 일을 하고 있습니다. 그 와중에 드디어 CHIMERY account를 받았습니다. 이제 두대의 workstation에 PD 3.0 와 CHIMERYS를 각각 설치를 완료하였습니다. Account를 받는데 왜 몇개월이 걸린지는 모르겠습니다. 특별한 설명도 없어서 이 부분은 Thermo 측에 아쉬움이 있습니다. 아무튼 포탈에 로그인을 하니 사용가능한 시간이 나옵니다. CHIMERYS User Portal (thermoscientific.com) Proteome Discoverer에서도 로그인을 하였습니다. 처음에 빨간색으로 보이던것이 로그인후 초록색으로 바뀌었습니다. 아래는 CHIMERY의 Default Pr.. 2022. 11. 20. Vanquish Neo Error (Needle stuck) 어처구니가 없다는 말을 이때 써야 되지 않을까 생각합니다. 9월달에 발생한 일입니다. 주말동안 돌아가는 장비가 갑자기 멈췄습니다. 에러메세지는 Neo LC autosampler 부분입니다. 일단 Autosampler의 tray가 돌아가지 않습니다. 보통 시스템을 restart를 하면 Self-test가 진행되면서 Needle과 Tray가 움직이게 됩니다. 하지만 이 단계가 진행되지 않습니다. 담당엔지니어의 스케쥴이 꽉 차서 다른 주에 있는 분이 급하게 오셨습니다. 급하게 온 것이 거의 3주를 기다렸습니다. 여러가지를 테스트를 하다 보니 어처구니 없는 것을 발견하였습니다. Viper tubing의 Tag가 Autosampler needle안에 박혀 있습니다. 하지만 마치 부품처럼 정확히 붙어 있어서 알아보.. 2022. 11. 16. 시료주입 양에 따른 단백질/펩타이드 수의 변화 앞의 글에서 시료전처리과정에서 30~40%의 손실이 있을수 있다는것을 확인하였습니다. 물론 상황마다 다르기 때문에 정확한 양은 알 수 없습니다. 그러나 아마 생각하는것보다 많은 양의 손실이 있을 수도 있을수 있을듯 합니다. 보통 75 µm x 25cm 컬럼에 1 혹은 2ug을 주입합니다. Nano column의 용량에 제한이 있기 때문입니다. Peak 모양이 퍼지기 전까지 최대한 주입하면 상관없습니다. 하지만 최대한의 양을 계속 주입하다보면 컬럼에 손상이 생실수도 있습니다. 긴 컬럼을 사용하면 더 많은 양을 주입할수 있습니다. 만약 Trap-column을 사용하게 되면 Trap-column의 용량도 고려해야 합니다. 아래는 보통 주입하는 양의 범위에서 시료의 양에 따라 단백질과 펩타이드의 수가 어떻게 차.. 2022. 11. 6. Pierce Peptide Quantitative Assay Protein digestion/clean-up 과정에서 얼마만큼의 시료의 없어질까? 실제 질량분석기에 주입되는 양은 얼마나 될까? 질량분석기를 위한 단백질 시료 전처리과정에서 많은 시료의 손실이 있습니다. 하지만 질량분석기에 주입할때는 시료의 손실이 없다고 가정하고 처음에 측정한 단백질의 농도를 고려해서 주입하는 경우가 있습니다. 물론 항상 동일한방법으로 주입하면 상관이 없습니다. Trypsin digestion후 C18 clean-up 과정에서 피할 수 없는 손실이 있습니다. 단백질마다 아미노산의 배열이 다릅니다. 또한 K와 R이 적절히 배치되어 있지도 않습니다. 그러므로 Trypsin digestion시 절단되는 펩타이드가 아주 작은 사이즈일 경우 C18에 결합하지 않고 빠져나옵니다. Trypsin.. 2022. 11. 3. 4mg Protein digestion clean-up, Sep-Pak C18, 500mg Sorbet Cartridge 많은 양이 단백질을 digestion후 clean-up을 할 때 적절한 C18 clean-up cartridge를 선택해야 됩니다. 특히 중요한 시료일 경우 시료의 손실을 최소화해야 합니다. 하지만 clean-up 과정에서 얼마나 손실이 되는지 알 수는 없습니다. 얼마전 4mg정도의 시료를 TMT11으로 처리한 시료를 clean-up을 하였습니다. 개인적으로 4mg정도의 시료의 경우 Sep-Pak C18, 500mg Sorbet Cartridge를 사용합니다. Shop Sep-Pak® C18 6 cc Vac Cartridges | WAT043395 | Waters Clean-up과정에서 얻어진 Flow-through와 Elution 을 각각 분석해보았는데 Flow-through에서는 펩타이드가 거의 검출.. 2022. 10. 25. hpRP DDV vs Gas-Phase Fractionation DDA for Extension Library Run (Spectronaut 16) FAIMS를 이용한 DIA 결과를 Spectronaut 16으로 검색시 FAIMS의 Gas-Phase Fractionation DDA 결과를 Extension Library Run으로 사용하고 있습니다. 한개의 시료를 동일한 조건이지만 서로 다른 CV값을 각각 분석하여 얻은 결과입니다. 이를 통해 DIA 결과에서 단백질과 펩타이드의 수를 상당히 향상시킬 수 있습니다. 이 분석법은 Direct DIA 분석법의 효율을 최대화 하기 위합니다. 기존의 분획후 DDA 분석으로 얻어진 Spectra-library를 사용하지 않습니다. hpRP DDV vs Gas-Phase Fractionation DDA 하지만 혹시나 Extension Library Run에서 분획후 얻어진 DDA 결과를 사용하면 어떤 결과가 있을.. 2022. 10. 25. 이전 1 ··· 12 13 14 15 16 17 18 ··· 61 다음
