프로테오믹스(단백체학)362 Haptoglobin O-linked glycopeptides의 PRM 정량분석 앞에서 설명한 Haptoglobind에 존재하는 HexNAC이 한개 붙은 O-linked glycopeptide 에 대해 Targeted PRM Assay를 해보았습니다. 관련글 HCD fragmentation 과 Proteome Discoverer 및 Byonic 을 이용한 O-linked glycopeptide 분석 0.5 ug HeLa 에 10, 50, 100, 200 ng Haptoglobin을 spiking 하였습니다. 두개의 펩타이드 form (VVLHPNYQVDIGLIK 와 VVLHPNYS(HexNAC)QVDIGLIK)을 사용하였습니다. PRM을 통해 검출된 각 펩타이드의 product ion은 아래와 같습니다 (Green color). Fragmentation과정에서 HexNac이 떨어지게.. 2020. 7. 23. HCD fragmentation 과 Proteome Discoverer 및 Byonic 을 이용한 O-linked glycopeptide 분석 O-linked glycopeptides 분석의 경우 N-linked glycopeptide 분석에 사용되는 PNGAse-F 와 같은 효율적인 enzyme이 없습니다. 하지만 N-linked glycan의 구조에 비해 상대적으로 적은 sugar가 붙은 경우가 많습니다. 이러한 이유로 많은 논문에서 Enzyme을 이용하지 않고 구조분석을 하는 경우가 많습니다. 일반 phospho, Acetyl, 그리고 methyl과 같은 PTM의 경우 PTM이 펩타이드 fragment에 결합된 상태로 나오기 때문에 Database 검색이 가능합니다. 하지만 O-linked glycopeptide의 경우 보편적으로 사용하는 HCD에서는 fragmentation 과정에서 glycan이 쉽게 떨어집니다. 그러므로 이론적인 스펙.. 2020. 7. 21. Byonic™과 Proteome Discoverer를 이용한 N-linked glycopeptides 의 Label-free quantitation 분석 Byonic과 Proteome Discoverer 를 이용하여 Glycopeptides 에 대해 label-free quantitation (LFQ) 를 분석하는 방법입니다. LC-MS/MS of a Haptoglobin glycoprotein (5 Replications) 먼저 당단백질인 human Haptoglobin을 동일한 조건에서 5번의 LC-MS/MS를 수행하였습니다. Full scan은 m/z 800-1800 이며 전하가 3,4,5 만 MS2가 수행하도록 하였습니다. Database Search with Byonic-incorporated Proteome Discoverer 1)파일을 불러옵니다. 2)Processing Workflow를 불러옵니다. 3)Consensus Workflow를 불.. 2020. 7. 14. Glycopeptides 구조분석을 위한 stepped NCE fragmentation 앞의 글에서도 설명을 한바 있지만 N-linked glycopeptides의 MS2 스펙트럼은 특징적인 부분이 있습니다. 먼저 낮은 m/z에 GlcNAc 혹은 Mannose 이 단일 혹은 두개 정도 붙은 oxonium ions 이 높은 감도로 나옵니다. 그리고 높은 m/z 영역에서 펩타이드에 여러 종류의 glycan이 붙은 피크들이 나옵니다. 그리고 m/z300 ~1000 사이에서 펩타이드의 backbone에 해당하는 -y, 혹은 -b 이온이 낮은 감도도 나옵니다. Glycopeptides가 HCD를 통해 조각이 날때 glycan이 쉽게 먼저 떨어집니다. 즉 사용되는 에너지들의 대부분이 펩타이드에 붙어 있는 glycan들을 조금씩 떼어내는데 사용됩니다. 이러한 이유로 일반적인 펩타이드에서 볼 수 있는 다.. 2020. 7. 11. Byonic™ – Protein Metrics 를 이용한 Disulfide bond 분석 이전에 Disufide bond 결합을 수작업으로 분석한 내용을 쓴적이 있습니다. 관련글) BSA를 이용한 Disulfide-linked Peptides 검출법 이번에는 Protein Metrics 사의 Byonic 프로그램을 이용하여 Disufide-linked 펩타이드를 검색해 보았습니다. Raw파일은 이전글에 사용한것과 동일한 BSA raw 파일입니다. 검색준비 먼저 Byonic 프로그램을 열고 관련된 파일을 업로드 합니니다. 그리고 S-S,Xlink 탭에서 Disufilde 를 체크하였습니다. 물론 일반 modification에서는 Carbamidomethyl (C)는 선택하지 않습니다. "Run"을 클릭하며 검색을 수행합니다. 결과생성 완료되면 폴더에 아래와 같이 다양한 파일이 생성됩니다. 펩타.. 2020. 7. 10. Matrix 에 따른 spike-in heavy isotope peptide 의 감도 변화 요즘 PRM을 이용하여 Absolute quantitation 을 연습하고 있습니다. Heavy isotope peptides 와 light peptides를 적절하게 혼합하여 적절한 calibration curve를 구하는것이 중요함을 깨닫게 됩니다. 일정한 농도의 heavy isotope peptide와 서로 다른 농도의 light peptides를 matrix에 spiking 하여 적절한 calibration curve를 구하게 됩니다. 재밌는 사실은 사실 낮은 농도의 standard의 경우 matrix 없이 주입하면 피크가 간혹 나오지 않을때가 있습니다. 정확한 이유는 모르겠지만 아마 trap-column과 analytical column의 C18에서 non-specific하게 결합한후 용리되지 .. 2020. 7. 8. 이전 1 ··· 50 51 52 53 54 55 56 ··· 61 다음
