프로테오믹스(단백체학)362 Biognosys 사의 Spectronaunt Pulsar의 DirectDIA 분석 (without Spectra library) Biogynosys 사의 Spectroanunt Pulsar 는 Spectra library 없이 Fasta 파일만으로 DIA를 분석할 수 있습니다. 프로그램을 엽니다. Set up a DirectDIA Analysis from file을 클릭합니다. DIA로 분석한 raw 파일들을 선택합니다. 저장할 파일이름을 만듭니다. 분석에 필요한 Fasta 파일을 선택합니다. directDIA분석에 필요한 파라미터 값을 불러옵니다 (여서기는 Default 사용) 분석한 DIA 파일에 대한 그룹을 선정합니다 최종적으로 Summary가 보입니다. Finish를 클릭하면 분석이 진행됩니다. 관련글] DIA분석(QE)에 있어서 m/z 500-900 과 mz 400-1000 검색구간에 따른 결과 차이 관련글] Skylin.. 2020. 9. 13. Biognosys 의 Spectronaut Pulsar 프로그램을 이용한 Spectra library 만들기 DIA 분석을 위해서는 Spectra library가 필요합니다. 보통 장비회사에서 사용하는 프로그램을 이용하여 Profiling한 output를 이용하여 생성합니다. Biognosys 사의 Spectronaunt Pular 프로그램도 raw 파일을 이용하여 database를 수행한여 Spectra library를 만들수 있습니다. raw파일과 해당 Fasta파일만 있으면 됩니다. Spectronanunt 프로그램을 열면 아래 왼쪽과 같이 Pulsar 을 이용하여 Library 를 만들수 있는 옵션이 있습니다. 여기를 클릭한후 해당 raw 파일들을 불러옵니다. 저장한 Library의 이름을 적습니다(예, HeLa_Pulsa_Library) 해당 fasta 파일을 선택합니다. 선택후 아래 오른쪽 그림과 같.. 2020. 9. 13. ESI에서 Single Charged Peptides 검출을 위한 팁 얼마전에 Single charged가 많이 포함된 펩타이드 시료를 의뢰받았습니다. N-terminal 이 modification 이 되어있고 trypsin 이 아닌 다른 enzyme을 사용하여 digestion된 시료였습니다. 즉 N-term이 modification이 되어있고 C-term은 Basic 인 K 혹은 R 이 아닌 경우 ESI에서 single charge로 나올수가 있습니다. ESI를 이용한 펩타이드 분석에서는 그 특성상 single charge 피크는 제외 시킵니다. background 나 chemical 피크들이기 때문이지요. 하지만 이 시료는 예외가 됩니다. 문제는 DDA 분석시 single charge 피크를 포함시킬 경우 많은 background 피크가 우선적으로 선택되어 실제 펩타.. 2020. 9. 10. Proteome Discoverer에서 Exclusion list 만드는 방법 동일한 시료를 Data Dependent Acquisition mode로 여러분 분석시 처음에 검출된 펩타이드는 다음 분석에서 검출이 안되도록 설정하며 새로운 펩타이드가 검출된 가능성을 높일수 있습니다. 이때 사용하는것이 Exclusion mode입니다. 간단하게 앞에서 검출된 펩타이드의 m/z값과 retention time를 삽입하면 됩니다. C의 재현성에 따라 retention time window는 좌우 각각 1분 혹은 그 이상으로 설정하면 됩니다. 이것은 iontrap에서는 효과가 별로 없고 high resolution이 가능한 장비에서 유용합니다. 주어진 시간에서 m/z 값이 10 ppm(변경가능)이내에서 일치하는것만 exclusion 시키도록 설정합니다. RT window를 넓게 하면 분석중에.. 2020. 9. 10. Short LC gradient에서 DDA 의 Top N 수 설정 동일한 조건에선 LC gradient 의 시간과 검출되는 펩타이드의 수는 비례합니다. 물론 일정 길이 이상으로 증가되면 새롭게 검출되는 펩타이드 수는 현저이 줄어듭니다. 분석할 시간에 제한이 없으면 최대한 LC gradient 시간을 늘여서 분석하는것이 좋겠지요. 하지만 제한된 시간안에서 최대한 많은 시료의 수를 분석해야 될 경우는 시료의 수나 LC gradient 시간 둘 중에 하나를 줄여야 됩니다. 의뢰가 들어온 시료의 수를 줄일수는 없음으로 LC gradient를 줄일수 밖에 없습니다. Complex 시료의 경우 LC gradient가 줄어들게 되면 검출되는 펩타이의 수가 줄어들게 됩니다. 하지만 이것을 어느정도 보상해 줄 수 있는 방법이 있다면 좋겠습니다. 이럴때 DDA에서 높은 수의 TOP N .. 2020. 9. 6. 많은 수의 human plasma 시료의 정량분석을 위한 전처리 방법 Plasma 시료전처리의 어려움 Plasma 시료 분석 의뢰는 일반 분석에 비해서 많은 수의 시료를 접수합니다. 상대적으로 채취가 쉬워서 일수도 있고 의미있는 단백질을 찾기 위해서 여러 환자로 부터 시료를 모을때 까지 기다렸다가 접수하는것이 하나의 이유가 될수 있습니다. 혈액시료의 특이성 때문에 전처리할때 상당한 주의가 필요합니다. 특히 환자시료에 따라 점성이 높기 때문에 파이펫 에러가 생길 가능성이 높습니다. 혈액시료는 농도가 아주 높기 때문에 (50~60ug/ul) 전처리 할때 많은 양을 사용하지 않습니다. 이러한 이유로 소량의 volume을 파이펫으로 옮기다 보면 작은 시료 손실에도 정량분석에 영향을 많이 줍니다. 파이펫으로 정확한 볼륨이 옮겨지지 않거나 혹은 파이펫 주위에 추가로 묻은 혈액으로 전.. 2020. 9. 5. 이전 1 ··· 47 48 49 50 51 52 53 ··· 61 다음
