프로테오믹스(단백체학)362 Negative mode로 장비내 contaminants 제거하기 프로테오믹스에서 펩타이드 분석은 대부분 positive ion모드에서 사용합니다. Positive ion mode에서는 positive ion들만이 질량분석기 내부를 거쳐서 검출기까지 도달하게 됩니다. 이때 positive 가 아닌 negative 혹은 neutral 이온은 질량분석기 안으로 들어가지 않거나 들어가더라도 중간에서 더 이상 이동을 하지 못합니다. 장기간 분석을 하게 되면 이러한 이온들은 질량분석기 내부에 붙게 되어 감도를 떨어뜨리게 됩니다. 종종 평소와 다르게 backgroup peak들의 intensity가 낮아지는걸 볼 수 있습니다. LC를 켜둔 상태에서 positive mode에서 항상 보이는 background peak들이 낮게 나올때 5분정도 negative mode로 작동시킨후 .. 2020. 10. 6. UPLC 시스템에서 PEEK Fingertight Fittings 으로 분석하기 UPLC 시스템에 PEEK Fingertight Fittings 을 사용하면 Troubleshooting을 많이 줄일수 있습니다. 최근에는 대부분의 nano LC는 UPLC 형태입니다. 고압에서 운용되기 때문에 모든 연결이 고압에서 견딜수 있는 연결부품(Tubings, Ferrule, Nut, sleeve)만이 사용됩니다 . UPLC는 Low pressure LC에 비해서 많은 장점을 가지고 있습니다. Particle size가 작은 C18(1.9 µm)과 긴 길이의 컬럼을 사용함으로써 peak resolution을 높여서 분리능을 증가시킬수 있습니다.이때 요구되는 고압을 견딜수 있어야 함으로 UPLC가 필수입니다. 하지만 가끔 Nano UPLC를 운영하다보면 잦은 troubleshooting으로 인해 .. 2020. 9. 29. Linchrosorb Si60 을 이용한 Frit column 만들기 대부분의 실험실에서 Laser puller 나 혹은 다른 방법등으로 Spray tip를 만들어 사용합니다. 즉 컬럼과 spray tip이 결합된 일체형을 사용합니다. 오래전 trap-column 혹은 analytical column을 만들때 Frit를 만들어 C18충진물을 고정시켰습니다. 이때 자주 사용한것이 sol-gel frit 입니다. 대표적인 방법으로 potassium silicate와 formamide 을 일정비율로 혼합한 용액에 Tubing 끝을 살짝 담구어서 고온에 장시간 두면 sol-gel이 형성되어 Frit이 됩니다 요즘은 Frit을 만들어 실험하는 경우가 거의 없는 것 같습니다. Nano UPLC 는 고압에서 운용되기 때문에 Frit 이 장착된 homemade trap-column 을 .. 2020. 9. 25. Spectronaut 의 directDIA 분석과 Spectra library 기반의 정량분석 비교 앞에서 Spectronanut 의 directDIA에 대해 간략히 언급하였습니다. 즉 Spectra library 없이 fasta file 만으로 분석하는 것입니다. 이번에는 HeLa digest에 서로 다른 양의 Ovalbumin을 첨가한후 그 실제 정량값이 잘 나오는지 확인해 보았습니다. 실험방법 1µg of HeLa Digest 당 10ng, 50ng, 100ng, 200ng Ovalbumin을 각각 첨가 Orbitrap Fusin을 이용하여 DIA 분석 얻어진 raw파일을 이용하여 directDIA와 Proteome Discoverer 2.4 로 검색한 Spectra library로 각각 분석하여 비교 먼저 이론적인 상대적 정량비율은 아래와 같습니다. 실험결과 아래 각각의 방법을 통해 얻어진 상대.. 2020. 9. 19. Thermo Altis Triple Quardrupole 을 이용한 Ovalbumin의 정량성 테스트 이전에 TMT, PRM, Label-free, DIA에 대한 정량성에 대해서 실험을 했었습니다. Complex Matrix에 서로 다른 양의 Ovalbumin을 첨가하여 이론값과 실제값을 비교하였습니다. 이전글) TMT 정량의 분석에서의 SPS MS3 방법은 진짜 좋은가? TMT 이전글) Spike-in Proteins for quantitative proteomics (Ovalbumin) PRM 이전글) [Biognosys spectronaut] DIA normalization Setting (Ovalbumin DIA 정량분석) DIA 이번에는 현재 보유하고 있는 Thermo 사의 Altis Triple Quardrupole 을 이용하여 동일한 시료를 이용하여 MRM을 수행하였습니다. LC는 앞의 실험.. 2020. 9. 17. Biognosys Spectronaut의 Pulsa, directDIA를 이용한 DIA 검색능력 비교 앞의 글에서 Biognosys 사의 Spectroanut 프로그램을 이용한 Pulsa와 directDIA 검색방법에 대해서 간략히 설명했습니다. 이번에는 실제 데이타를 이용하여 Proteome discoverer를 통해 얻어진 spectra library 결과와 비교해보았습니다. Spectra library는 1mg HeLa digest 를 HPLC 기반 hPRP로 분획후 DDA 분석을 통해 얻어진 결과를 사용하였습니다. DIA 분석을 위해서는 100ng Hela standard digest(Pierce)를 Q-Exactive HFX로 8번 반복분석한 결과를 사용하였습니다. Spectra Library 생성 DDA raw 파일을 Proteome Discoverer 2.4 로 검색후 output 파일을 S.. 2020. 9. 14. 이전 1 ··· 46 47 48 49 50 51 52 ··· 61 다음
