Orbitrap Eclipse에서 DIA Isolation window값 정하기

"Orbitrap Eclipse에서 DIA 분석조건의 최적화를 위해 먼저 적절한 Isolation window값을 찾고자합니다."

 

 

Orbitrap Eclipse 설치후 DDA 실험방법 테스트는 거의 끝낸것 같습니다. 이번에는 적절한 DIA Method를 만들려고 합니다.  사실 모든 실험방법마다 최적화를 하면 좋겠지만 어느정도의 만족할만한 단백질/펩타이드수만 검출될수 있다면 무난히 사용해도 될듯합니다. DIA만을 전문적으로 하는 실험실이라면 보다 더 세밀하게 최적화를 해야겠지요.

Orbitrap Eclipse의 빠른 속도와 감도로 인해서 이전 장비에 비해서 isolation window를 조금더 줄여도 될듯합니다. 하지만 검출수와 더불어 중요한것은 각 피크당 Data point의 수입니다. 보통 8~10개정도로 할려고 합니다.

3가지 isolation window (20 m/z, 25m/z, 30m/)를 사용하여 측정해보았습니다. MS2 parameter의 AGC와 Maximum Injection time은 Standard 와 Auto로 설정했습니다. 20m/z보다 더 적으면 검출수는 많아지겠지만 data point는 줄어들것이고 30 m/z보다 높으면 data point는 증가하겠지만 검출수는 줄어들지 않을까 생각합니다. 


아래는 200ng HeLa standard를 이용하여 15cm EasySpray 컬럼에서 얻어진 대표적인 크로마토그램입니다.

Protein and Peptide Number

각각의 Isolation window에서 얻어진 단백질 및 펩타이드 수입니다. 특별히 검출수에는 큰 차이가 없는듯합니다. Isolation window가 커질수록 검출수는 약간 감소되는듯합니다. MS2의 스펙트럼의 더 복잡해짐에 따라 검출되는 수는 줄어드는듯 합니다.

 

 

 

Data Points

각각의 Isolation window에서 얻어진  Data point 수입니다. 대략 중간값이 8~10사이가 나옵니다. 예상대로 isolation window가 커질수록 data point는 조금씩 증가하는듯합니다.  Gradient가 길어지거나 peak width가 바뀌면 이 값들은 바뀔수 있습니다. 대략 20 m/z 나 25m/z에서 사용하면 적절한 단백질/펩타이드수와 더불어 정량분석에 필요한  충분한 data point를 얻을수 있을듯합니다.  
.

 

 

DIA with 2ug Human Proteins

Promega사의 human extract를 digestion하여 2ug을 5번 분석한 결과입니다. (25cm column, 2hr gradient)

Data point는 평균 9개입니다.

 

 

 

Spectronaut 15 의 Direct DIA 방법으로 분석한 단백질 및 펩타이드 수입니다. 대략 4700개의 단백질이 검출되었습니다. 조금더 많이 검출될것을 기대하였지만 그래도 괜찮은 숫자인듯합니다. 

 

검출된 Precursor에 대한 missing value 입니다. missing value값이 거의 없이 5번의 분석에서 99.3%가 모두 다 검출되었습니다. 

이것을 기준으로 AGC값이나 Maxium injection time을 조절하면서 조금더 최적화하면 될듯합니다.

 

 

 

 

이전글

Orbitrap Exploris 480 Benchmark (Data Independent Acquisition)

Orbitrap Exploris 480 Benchmark (Data Independent Acquisition)

Skyline의 DIA method 설정에서 Window 수와 Optimize window placement 에 따른 비교 분석 (QE-HF)

Skyline의 DIA method 설정에서 Window 수와 Optimize window placement 에 따른 비교 분석 (QE-HF)

간단한 DIA method 조건 테스트

간단한 DIA method 조건 테스트