프로테오믹스(단백체학)361 C18 Spin-column 분획후 Oribtrap Eclipse로 10,000 단백질 검출하기 100 µg시료 (Human K562+Yeast)를 C18 Spin-column 이용하여 Orbitrap Eclispe에서 10,000개 단백질 검출하기 사전 분획(Pre-Fractionation)은 실험에 따라 반드시 필요한 단계입니다. HPLC장비를 이용하여 분획을 하면 좋겠지만 최근에서는 대부분은 Spin-column 을 이용하여 Small scale로 분획을 합니다. 고가의 HPLC 가 필요없음뿐더러 소량의 단백질만 있으면 됩니다. 높은 질량분석기의 감도로 인해 small scale의 분획으로도 충분히 많은 단백질을 검출할수 있습니다. Thermo 사의 Pierce™ High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit (P/N 84868) 가 있긴 하지만 실험실.. 2022. 3. 28. Orbitrap Eclipse + FAIMS로 단백수/펩타이드 검출수 증가시키기 120min Gradient에서 약 6400 단백질 검출 아직 최적화 되지 않은 상태이지만 FAIMS를 이용하여 1ug K562 단백질에서 120min gradient로 약 6400개의 단백질을 검출하였습니다. 분획을 하지않은 120min LC gradient 조건을 고려할때 꽤 많은 단백질이 검출되는것 같습니다. 특별히 기대를 하지 않았는데 예상외로 좋은 결과인것 같습니다. 아래는 FAIMS를 장착하고 몇가지 테스트를 진행한 내용입니다. CV값에 따른 검출 단백질/펩타이드 종류 장비앞에 그냥 붙힌후 대표적인 2개의 CV값만 사용하면 될것 같지만 CV값에 따라 검출되는 펩타이드의 종류가 상당히 다르게 검출됩니다. 그렇기 때문에 시료의 종류나 시료의 양에 따라 최적의 CV값이 달라질수도 있을듯합니다. CV.. 2022. 3. 28. Orbitrap Eclipse 와 FAIMS가 만나다 특별히 장비를 업그레이드를 하지 않고도 감도를 증가시킬수 방법이 있다면 좋을듯합니다. FAIMS도 그중에 하나가 아닐까 생각합니다. 새로운 기술을 위해 Bruker사의 Ion mobility 장비를 구매하면 좋겠지만 FAIMS를 이용하면 기존의 Orbitrap 장비(e.g, Exploris 480, Orbitrap Eclipse)에서 추가적인 감도를 얻을수 있습니다. 사실 Exploris480이나 Orbitrap Eclipse는 감도가 좋아서 굳이 FAIMS를 장착하여 단백질/펩타이드의 수를 증가시킬 필요가 있을까 생각합니다. 그래서 FAIMS의 기능을 최대한 활용할수 있는 실험을 찾는것이 중요할듯 합니다. 이전에 Exploris480에 부착하여 테스트한 결과가 이전글에 있습니다. 이전글 FAIMS를 이.. 2022. 3. 27. Nano Column Packing 시스템 설치 새 연구소와서 가장 먼저 주문한것중 하나가 Column packing 시스템이었습니다. 일단 가장 필요한것을 먼저 주문하라고 들었을때 가장 먼저 생각한 장비입니다. 파이펫이나 다른 필요한 소모품보다 가장 먼저 주문하였습니다. Pressure Injection Cells - Next Advance Next Advance 사의 Pressure Injection Cell- P77-MAG 와 High pressure Regulator 와 기타 악세사리가 포함된 kit를 주문하였습니다. Regulator는 따로 저렴하게 구매할수 있지만 번거로워서 함께 주문하였습니다. Regulator는 Agilent사 제품이 들어있습니다. Agilent도 아마 OEM으로 판매하지 않을까 생각합니다. 규격만 맞으면 어느 회사 제품.. 2022. 3. 26. Qualbrowser 에서 DIA data point 수 확인하기 Spectronaut로 검색을 하게 되면 결과값에 data point 수를 확인할수 있습니다. 하지만 정확하지는 않지만 Qualbrower에서도 대략 확인할수 있습니다. MS2 스펙트럼중에서 대락 큰 피크를 하나 골라서 Extracted Ion chromatogram(XIC) 을 만든후 피크의 수를 세어보면 됩니다 아래와 같이는 DIA에 얻어진 base-peak chromatogram입니다. 대략 중간쯤에서 클릭해서 MS2 피크중에 상대적으로 큰 피크를 하나 선택합니다(e.g,m/z 715.3987). 이 피크를 이용하여 MS2 스펙트럼에서 XIC 를 만듭니다. 해당 피크가 있는 피크를 확대해서 피크의 갯수를 세어보면 됩니다. 유사한 m/z 값이 많기 때문에 마치 base-peak chromatogram.. 2022. 3. 25. Orbitrap Eclipse에서 DIA Isolation window값 정하기 "Orbitrap Eclipse에서 DIA 분석조건의 최적화를 위해 먼저 적절한 Isolation window값을 찾고자합니다." Orbitrap Eclipse 설치후 DDA 실험방법 테스트는 거의 끝낸것 같습니다. 이번에는 적절한 DIA Method를 만들려고 합니다. 사실 모든 실험방법마다 최적화를 하면 좋겠지만 어느정도의 만족할만한 단백질/펩타이드수만 검출될수 있다면 무난히 사용해도 될듯합니다. DIA만을 전문적으로 하는 실험실이라면 보다 더 세밀하게 최적화를 해야겠지요. Orbitrap Eclipse의 빠른 속도와 감도로 인해서 이전 장비에 비해서 isolation window를 조금더 줄여도 될듯합니다. 하지만 검출수와 더불어 중요한것은 각 피크당 Data point의 수입니다. 보통 8~10개.. 2022. 3. 19. 이전 1 ··· 23 24 25 26 27 28 29 ··· 61 다음
