프로테오믹스(단백체학)362 Orbitrap Eclipse에서 DIA Isolation window값 정하기 "Orbitrap Eclipse에서 DIA 분석조건의 최적화를 위해 먼저 적절한 Isolation window값을 찾고자합니다." Orbitrap Eclipse 설치후 DDA 실험방법 테스트는 거의 끝낸것 같습니다. 이번에는 적절한 DIA Method를 만들려고 합니다. 사실 모든 실험방법마다 최적화를 하면 좋겠지만 어느정도의 만족할만한 단백질/펩타이드수만 검출될수 있다면 무난히 사용해도 될듯합니다. DIA만을 전문적으로 하는 실험실이라면 보다 더 세밀하게 최적화를 해야겠지요. Orbitrap Eclipse의 빠른 속도와 감도로 인해서 이전 장비에 비해서 isolation window를 조금더 줄여도 될듯합니다. 하지만 검출수와 더불어 중요한것은 각 피크당 Data point의 수입니다. 보통 8~10개.. 2022. 3. 19. EasySpray 컬럼, 어떤 길이의 컬럼을 선택할까? 실제 실험에서 사용할 컬럼의 길이를 정하는 중입니다. 테스트용으로는 15cm 컬럼이 적당하지만 실제 DIA 나 TMT 분석 실험에 사용하기 위해서는 조금더 더 긴 컬럼이 필요합니다. 가능하면 긴 컬럼을 사용해서 더 좋은 결과를 얻고 싶은 마음이 있습니다. EasySray컬럼의 경우 50cm길이의 컬럼을 사용하더라도 heating이 되기때문에 아주 큰 압력은 걸리지 않습니다. 하지만 최종적으로 25cm 으로 사용하기로 하였습니다.압력도 적절하고 50cm 컬럼에 비해서 피크모양도 크게 차이가 나지 않습니다. 무엇보다 다양한 종류의 실험에 마음편하게 적절히 사용될수 있을것 같습니다. 아래는 Promega사의 Human extract 를 digestion 후 2ug을 주입한 2시간 길이의 크로마토그램입니다. 7.. 2022. 3. 18. Expected LC peak Widths 의 설정값과 단백질 검출수 관계 오래전이지만 Thermo 사의 specialist로 부터 Expected LC peak Widths 값을 적절히 정해줘야 된다고 전해들었습니다. Expected LC peak Widths는 AGC값을 적절히 계산하는데 사용된다고 적혀있습니다. Peak의 넓이를 예상하면 대략 피크의 바닥과 꼭지를 예측할수 있는듯합니다. 이를 이용하여 적절한 AGC를 값을 계산하는가 봅니다. 하지만 모든 peak들이 일정한 피크모양을 가지는것이 아닐것이며 또한 대칭으로 나오지 않을텐데 이 기능이 펩타이드 혼합물에 얼마나 효율적인지는 모르겠네요. Manual에는 10 % valley(FWTM, Full Width at 10 % maximum) 값을 사용하라고 적혀있습니다. 대략 현재 컬럼에서는 나오는 피크의 FWTM값을 확인.. 2022. 3. 16. 6분만에 단백질 분석하기 (커피한잔하고 와서 결과보기) 분석시간이나 장비시간에 특별히 제한이 없을 경우 간단한 단백질을 분석할때도 기존에 사용하던 긴 LC time 방법을 그냥 사용합니다. 하지만 분석결과에 큰 영향을 주지 않는 선에는 최대한 짧은 시간에 분석을 끝낼수 있다면 주어진 시간에 더 많은 시료를 분석할수 있습니다. 이전에도 글을 올린적이 있습니다. 짧은 LC gradient로 단일단백질 검출하기 이번에는 EasySpray컬럼이 연결된 Vanquish Neo 와 Orbitrap Eclipse를 사용해서 더 짧은 시간에 검출을 해보았습니다 짧은 EasySpray컬럼의 장점을 잘 활용하면 간단한 단백질을 빠른시간내에서 감도의 큰 감소없이 분석할수 있습니다. 시료수가 매우 많을 경우 더 효율적일수 있습니다. 15cm길이의 EasySpray컬럼은 길이가 짧.. 2022. 3. 16. MaxQuant vs Proteome Discoverer 2.5 (DDA and TMT11) Proteome Discoverer 2.5와 MaxQuant 프로그램을 간단히 비교해보았습니다. 기존논문에 나온것처럼 철저하게 비교한것은 아니고 대략 어느정도 차이가 나는지 궁금해서 보았습니다. 사실 프로그램별로 장단점이 있기 때문에 단백질수만으로 비교하는건 큰 의미가 없을듯합니다. 또한 프로그램마다 최적화된 방법이 있을수 있습니다. 혹시 차후에 다른 사람들이 물어보면 대략 대답을 해줄정도의 비교는 해보는게 좋을듯합니다. 이전글 Proteome Discoverer vs MaxQuant 이전에 분석한 200ng DDA(60min LC gradient) 와 최근에 테스트한 Pierce QC TKO TMT11 분석결과를 각각 MaxQuant 와 Proteome Discoverer 2.5로 분석해보았습니다. D.. 2022. 3. 13. 긴 컬럼을 사용할때의 고려해야 될 점 논문에서 보면 긴 컬럼을 사용하여 많은 단백질을 검출하거나 혹은 아주 극미량 단백질을 검출한 방법이 소개됩니다. 사실 이런 논문을 보면 직접 적용해보고 싶은 마음이 들곤합니다. 하지만 아주 긴 컬럼을 사용하는것이 꺼려지는 이유중 하나는 높은 압력으로 인해 시스템에 무리가 많이 가기 때문입니다. 과연 일반실험실에서 논문에 나온방법을 이용하여 매일 사용할수 있을지 의문입니다. 또한 논문에 나온 실험실로 과연 매일 사용하는지 아니면 논문을 발표한후 더 이상 사용하지 않는지도 모릅니다. 가끔씩 50 cm 컬럼을 사용해볼때가 있습니다. 하지만 압력도 문제이지만 좋은 Gradient 조건을 찾는것이 쉽지 않습니다. 특히 Void volume이 상대적으로 크기 때문에 첫 펩타이드 피크가 나오는데 상당한 시간이 걸립니.. 2022. 3. 9. 이전 1 ··· 24 25 26 27 28 29 30 ··· 61 다음
