프로테오믹스(단백체학)361 Canonical vs Canonical & Isoform fasta file Mouse liver 에서 단백질을 검출한후 Proteome Discover에서 MSFragger 를 사용하여 검색을 하였습니다. 2hr LC gradient에서 8,000여개의 단백질이 검출이 되어서 대박이 났구나 생각했습니다. 알고 보니 검색설정을 제대로 하지 않아서 Proteingroup로 표시되지 않았기 때문입니다. Uniprot에서 fasta file을 다운받게 되면 Canonical과 Canonical & isoform 이 보이게 됩니다. https://www.uniprot.org/help/canonical_and_isoforms 쉽게 생각해서 Isoform이 포함된 Sequence로 단백질을 검색하면 더 많은 단백질이 검출이 될것이라 예상이 됩니다. 하지만 Proteome discoverer.. 2022. 5. 14. Oribtrap Eclipse+FAIMS로 Human+Yeast 혼합시료에서 14,000 단백질 검출하기 이전 실험에 사용했던 시료를 FAIMS를 장착하여 분석해보았습니다. PD2.5에서 MSFragger 와 INFERYS Rescoring 추가로 단백질/펩타이드수 증가시키기 (10,600개에서 12,000로 증가) (tistory.com) PD2.5에서 MSFragger 와 INFERYS Rescoring 추가로 단백질/펩타이드수 증가시키기 (10,600개에서 12,000로 증 "Proteome Discoverer 2.5 에서 Sequest HT에 INFERYS Rescoring 와 더불어 MSFragger node를 추가하면 더 많은 단백질과 펩타이드를 공짜로 더 검출할수 있습니다." Human + Yeast시료를 이용하여 약 10,000개의.. proteomicstechnology.tistory.com.. 2022. 5. 12. Peptide fractionation of non-TMT and TMT mixture using C18 spin-column 높은 감도의 질량분석기 덕분에 HPLC를 이용한 펩타이드 분획보다는 Stage-tip(Spin-column)을 이용해서 간단히 분획을 합니다. 그중에 High-pH Buffer를 이용한 분획이 가장 쉽고 유용한것 같습니다. 하지만 stage-tip에 충진되는 C18의 종류, 사이즈나 Buffer에 따라 분획되는 패턴이 다르게 됩니다. Stage-tip에 충진되어 있는 C18도 제조회사에 따라 particle size나 Carbon loading 양 다릅니다. Buffer의 종류에 따라 서로 elution strength가 다를 수 가 있습니다. 또한 TMT 가 결합된 펩타이드는 더 hydrophobic하기 때문에 일반 펩타이드과 다른 패턴을 가집니다. 그러므로 본인이 주로 사용하는 Stage-tip 와 .. 2022. 5. 10. Trap-column과 Analytica column 교체시기 많은 시료를 분석하다보면 시스템에 문제가 있어서 잘 인식하지 못하는 경우가 있습니다. 혹시 발견하더라도 큰 문제가 아니라면 그냥 무시하고 지나갈때도 있습니다. 시스템의 상태가 좋지 않다고 판단할수 있는 근거는 여러가지일수 있습니다. HPLC시스템은 크로마토그램을 통해서 쉽게 판단할수 있습니다. 질량분석기의 장비의 경우는 검출되는 단백질및 펩타이드의 수를 통해 먼저 판단할수 있습니다. 하지만 단백질과 펩타이드의 수의 감소는 질량분석기가 아닌 그 앞쪽 시스템 즉 HPLC에서의 문제일수도 있기 때문에 무작정 질량분석기를 탓할수도 없습니다. 이번주는 우연히 Trap-column과 Analytical column의 효율이 떨어진것을 발견하게 되었습니다. 이전 글에도 적혀있지만 trap-column의 경우 결합력이.. 2022. 5. 9. Orbitrap Eclipse로 Histone H3의 Middle-down 펩타이드 분석하기 Histone 은 그 특성상 일반적인 bottom-up 방법으로는 분석이 거의 불가능합니다. Propionylation 과 같은 유도체화를 시킨후 분석하는 bottom-up 과 Glu-C와 같은 enzyme을 이용하여 middle-down 방법을 사용합니다. Histone Propinolylation을 통한 bottom-up proteomic analysis (tistory.com) Histone H3 variants를 Glu-C로 절단하면 50개 이상의 amino acid를 가지는 큰 펩타이드가 생성입니다. 이렇게 긴 펩타이드에서 다양한 Isobaric PTM을 검출하는것은 쉽지 않습니다. LC와 MS 부분에서 최적화가 필요합니다. 실제 Histone 시료의 경우 다양한 PTM이 존재하기 때문에 PTM.. 2022. 5. 1. FAIMS의 활용성 Orbitrap Eclipse에 FAIMS를 장착하기 전까지는 FAIMS의 활용성에 대해서 큰 확신이 없었습니다. 사실 Eclipse자체만으로도 대부분의 실험을 다 할수 있습니다. FAIMS가 없어서 하지 못하는 실험은 없을것이라 생각합니다. 기존장비에 뭔가를 장착할때는 장단점을 잘 고려해서 결정합니다. 그렇지 않으면 구매후 활용성이 떨어져서 거의 사용하지 않는 부품들이 많이 있습니다. FAIMS도 그렇지 않을까 생각하였지만 아직까지는 상당히 만족하는 편입니다. Eclipse에서 충분히 많은 단백질이 검출됩니다. 하지만 FAIMS를 장착하여 더 많은 단백질을 검출하고 나면 이전의 단백질수에 만족이 되지 않습니다. 최근 여러가지로 테스트를 해보았는데 특별히 아주 양이 적은 시료의 경우 FAIMS의 효과가 .. 2022. 4. 26. 이전 1 ··· 21 22 23 24 25 26 27 ··· 61 다음
