프로테오믹스(단백체학)361 Orbitrap Eclipse, EasySpray 50cm, 200ng HeLa에서 5500개 단백질 검출 얼마전 Thermo사의 Field application engineer로 부터 Orbitrap Eclipse에서 분석한 raw file를 한개 받았습니다. 여러 연구소에 설치된 Orbitrap Eclipse의 장비상태를 확인할때 분석한 결과들이 있습니다. 그중에 좋은 결과를 한개 받았습니다. 동일한 MS-spec 의 조건을 사용하였고 컬럼도 동일한 규격의 컬럼을 사용하여 분석하였습니다. Mass spectrometry: Orbitrap Eclipse (OT-IT mode, Rapid) HPLC: Vanquish Neo Trap-column : no Trap-column Analytical Column: EasySpray 75µm x 50cm, 2µm C18 Buffer A: 0.1% F.A. in H2O.. 2022. 4. 15. Thermo사 TKO TMT11 대신 실험실에 TMT11 standard 만들기 Thermo 사에서 TMT11 분석을 위한 standard mixture를 판매하고 있습니다. 지난번 구매해서 분석을 해보았습니다. Orbitrap Eclipse의 MS3 SPS Real-time search를 활용한 TMT 분석 (TKO TMT 11-plex standard) 가격은 20 µg에 340불정도입니다. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A40938 바로 분석할수 있도록 만들어져 있기 때문에 아주 유용한것 같습니다. Labeling이나 기타 전처리 과정을 할필요가 없습니다. 20 µg이지만 (아마도)펩타이드 수준에서 정량이 된것이라 실험실에서 Digestion하여 얻은 20 µg보다는 더 많은 양입니다. 보통 한번 분석시 100 ng정.. 2022. 4. 10. Orbitrap Eclipse+FAIMS로 200ngHeLa에서 5613개 단백질 검출 Orbitrap Eclipse와 FAIMS(120min LC time)를 이용하여 200ng HeLa standard에서 약 5613개의 단백질검출 Orbitrap Eclipse+FAIMS에 대한 Reference data를 만들기 위해서 100ng HeLa standard를 이용하여 몇개의 단백질이 검출되는지 확인해보았습니다. MS2는 iontrap 으로 분석하였고 임의로 몇가지 파라미터를 다르게 적용보았습니다. Mass spectrometry: Orbitrap Eclipse (OT-IT mode) HPLC: Vanquish Neo Trap-column : Acclaim PepPap, 75µm x 20mm, 3µm, 100A Analytical Column: EasySpray 75µm x 25cm, 2.. 2022. 4. 5. Orbitrap Eclipse+FAIMS으로 1ng HeLa standard 에서 단백질검출하기 Orbitrap Eclipse와 FAIMS(60min LC time)를 이용하여 1ng HeLa standard에서 약 1500개의 단백질을 검출하였습니다. FAIMS를 잘 활용할수 있는 실험중 하나가 극미량의 시료를 분석하는것이 아닐까 생각합니다. 시료의 양이 적을수록 background 피크에 의해서 suppression 되는 영향이 상대적으로 큽니다. 보통 MS1 스펙트럼에서 펩타이드 피크들이 거의 보이지 않게 되거나 보이더라도 높이가 매우 낮습니다. 이로인해 background 피크들과 혼합되어 charge state가 구별이 안될경우가 있습니다. Precursor ion의 피크가 높지 않으면 상대적으로 좋은 MS2 스펙트럼을 얻을수 없습니다. 또한 Charge state를 정확히 구별하지 못하면.. 2022. 4. 2. EasySpray column(75µm x 25cm, 2µm C18)의 180min gradient chromatogram EasySpray column (75um x 25cm, 2um C18)에서 3시간 LC gradient에 적합한 조건을 찾아보았습니다. 개인적으로는 3시간 LC gradient를 그다지 좋아하지 않습니다. 단백질은 더 많이 찾을수 있겠지만 하루에 분석할수 있는 시료수가 많지 않습니다. HPLC: Vanquish Neo Trap-column : Acclaim PepPap, 75µm x 20mm, 3µm, 100A Analytical Column: EasySpray 75µm x 25cm, 2µm C18 Buffer A: 0.1% F.A. in H2O/ Buffer B: 80% ACN+20% F.A. Flow rate: 300nL/min Sample: 1µg K562 먼저 120 min LC gradient .. 2022. 3. 31. PD2.5에서 MSFragger 와 INFERYS Rescoring 추가로 단백질/펩타이드수 증가시키기 (10,600개에서 12,000로 증가) "Proteome Discoverer 2.5 에서 Sequest HT에 INFERYS Rescoring 와 더불어 MSFragger node를 추가하면 더 많은 단백질과 펩타이드를 공짜로 더 검출할수 있습니다." Human + Yeast시료를 이용하여 약 10,000개의 단백질이 검출되었습니다(이전글 참조). C18 Spin-column 분획후 Oribtrap Eclipse로 10,000 단백질 검출하기 동일한 raw file들을 사용하여 Proteome Discover 2.5에서 MSFragger 를 추가하여 검색하였습니다. 또한 Proteome Discoverer 2.5에서 새롭게 포함된 INFERYS Rescoring node를 추가였습니다. Sequest HT with INFERYS Rescori.. 2022. 3. 29. 이전 1 ··· 22 23 24 25 26 27 28 ··· 61 다음
