이전 글에서 TMT분석에 있어서 SPS MS3의 유용성에 대해서 간단히 테스트를 했었습니다. 그 외에 몇가지 분석 parameter 에 대한 테스트를 한것이 있어서 정리 하였습니다.
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MS3 Resolution
10Plex TMT의 경우 Reporter ion의 분자량 차이가 많이 나지 않음으로 high resolution 이 요구됩니다. 그렇지 않을 경우 정량값에 영향을 줄수 있습니다. 일반적으로 Orbitrap Fusion으로 10-plex TMT 분석을 위해서는 60K의 분리능이 요구됩니다. 최근 SPS MS3 를 이용하여 MS2 기반에서 문제가 되는 TMT reporter ion의 supression를 해결하고 있습니다. 관련 논문을 찾아보니 reporter ion 검출을 위해서 MS3에서 resolution을 30K로 사용하는걸 보았습니다.
아마 MS2에 비해서 MS2 와 MS3를 동시에 사용해야 됨으로 cycle time등을 최대한 줄일려고 한것 같습니다. 30K를 사용해도 정량분석에 영향이 없다는걸 짐작할수 있습니다.
10-plex TMT로 labeling된 시료를 이용하여 확인해보았습니다. 아래는 10-plex로 labeling 된 시료중에 128.1281과 128.1341에 대해 15K, 30K, 60K에서의 분리능을 보여줍니다.
15K에서도 거의 분리는 되지만 완전히 baseline에서 분리는 되지 않습니다. 30K는 거의 baseline 분리를 보여주며 60K에서는 확실히 두 피크가 분리가 되었습니다. 여기에서 보면 30K를 사용하더라도 정량분석에는 큰 영향이 없어 보입니다. 미비하게 겹치는 부분이 있지만 이로 인해 정량값에 차이가 나지 않을것 같습니다.
MS3 Scan Range
SPS MS3 분석에 있어서 Reporter ion을 검출하는 MS3는 정성보다는 정량분석에 초점이 맞춰서 있습니다. 실제 펩타이드 동정은 iontrap MS2에서 이루어지며 MS3의 경우 Reporter ion이 최대한 높은 감도로 검출될수 있도록 아주 높은 HCD collision energy 를 사용합니다. 그래서 굳이 scan range를 넓게 할 필요가 없이 reporter ion이 검출되는 영역만 scan 합니다. 기존의 논문에서는 m/z 100-1000 를 사용하였습니다. 간단히 m/z 100-1000 와 m/z 100-500 두 영역에서 비교를 해보았습니다.
예상은 하였지만 특별히 차이는 없는것 같습니다. scan range의 차이가 cycle time 등에 큰 영향을 주지 않으리라 생각합니다.
Trypsin vs Lys-C Digestion
MS3에서 Reporter ion 을 검출하고 정량분석하기 위해서는 MS2의 product ion들이 TMT가 붙어 있어야 합니다.
TMT는 peptide의 N-terminal 와 Lysine(K)에 결합합니다. 그래서 Trypsin으로 절단을 할 경우 C-terminal에 Lysine(K)이 있는 경우는 K 과 N-terminal에 각각 TMT가 결합합니다. 하지만 C-terminal에 Arginie (R)이 존재할 경우 N-terminal에만 TMT가 붙어 있습니다. 이 두가지 펩타이드가 MS2 에서 fragmentation 될 때 K이 존재하는 펩타이드의 경우 b 와 y 이온에 모두 TMT가 붙어 있습니다. 하지만 Arginie 으로 절단된 펩타이드의 경우 b ion에만 TMT가 붙어 있게 됩니다. 즉 MS3를 수행할때 TMT가 없는 product ion이 MS3로 될수 있습니다.
Lys-C로 절단한 경우는 이러한 현상이 일어나지 않고 모든 product ion들은 TMT가 붙어있게 됩니다. 이론적으로 본다면 TMT SPC MS3는 Lys-C digestion에서 더 효과적이라고 생각할 수 있습니다. 최근 몇개의 논문에서는 여전히 trypsin을 사용하고 있었습니다.
그래서 동일한 시료를 Tryspin과 Lys-C로 digestion후 TMT labeling을 하여 간단히 테스트를 했습니다. 결과는 아래 그래프에서와 같이 tryspin에서 여전히 높은 수의 단백질과 펩타이드가 검출되었습니다. 이론적으로는 Lys-C가 좋을 수 있지만 digestion efficiency 혹은 절단되는 펩타이드의 길이등을 고려할때 trypsin이 여전히 좋은것 같습니다. 혹은 trypsin을 사용해보 별 문제가 없다는것을 알수 있습니다.
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