프로테오믹스(단백체학)362 FAIMS) Orbitrap Exploris 480 FAIMS Benchmark (Data-dependent Acquisition) 최근 논문과 강좌에서 많이 등장하고 있는 FAIMS를 드디어 테스트 해보게 되었습니다. 사실 장비에 뭔가 새로운것을 붙히는것을 그다지 좋아하지는 않습니다. 얻는것보다 잃는것이 많을 때가 있기 때문입니다. 업체들은 보통 장점만을 강조하며 또한 최적화된 상태에서 실험한 결과를 보여주기에 실제 실험실에서의 상황과 다를수 있기 때문입니다. 하지만 여러 논문에서 좋은 결과들이 나온것을 보면서 기대하는 마음으로 조금씩 테스트해보았습니다. Nanoflow에서는 0 L/min을 사용을 해야 합니다. 그렇지 않으면 nanoflow에서는 gas로 인해 이온들이 질량분석기로 들어가는것을 방해받을수 있습니다. Resolution mode의 경우 대부분의 프로테오믹스 실험에서는 “standard resolution”을 사용합니.. 2021. 6. 30. Orbitrap Exploris 480 Benchmark (Data Independent Acquisition) 이번에는 Data Independent Acquisition에 대한 간단한 Benchmark 데이타입니다. 200 ng HeLa standard digest를 이용하여 몇가지 조건에서 DIA를 수행하여 Spectronaut로 검색을 하였습니다. 또한 Overlap 방식을 이용한 DIA를 이용하여 EncyclopeDIA를 통해 검색하여 결과를 얻었습니다. Non-overlap DIA with a Spectronaut search 아래는 서로 다른 DIA isolation window (10 mz vs 20 mz), MS2 AGC, MS2 Maximum injection time 에서 얻어진 단백질과 펩타이드의 수 와 missing value 입니다. 20 m/z보다는 10 m/z가 상대적으로 더 많은 단백.. 2021. 6. 29. Thermo Orbitrap Exploris 480 Benchmark (Targeted Assay, PRM) 이번에는 Targeted Assay 인 Parallel Reaction Monitoring (PRM)에 대한 Benchmark 실험을 하였습니다. 최근 장비들은 Isolation의 효율이 매우 뛰어나기 때문에 0.5 m/z 와 같은 narrow isolation을 이용하여 정량분석을 하면 좋은 결과를 얻을수 있습니다. . 감도가 줄어들지 않으면서 interference peak들을 최대한 제거할수 있습니다. 만약 최대한 target ion만을 isolation 한후 있다면 동일한 AGC 값에서 보다 더 많은 target ion들만을 모을수 있습니다. 0.5 m/z and 1.5 m/z isolation for PRM (BSA) 아래는 100 fmol BSA를 이용하여 0.5 m/z와 1.5 m/z iso.. 2021. 6. 29. Thermo Orbitrap Exploris 480 Benchmark (Data-Dependent Acquisition) 2021년 초에 설치되었던 Exploris 480이 다른 큰 프로젝트를 수행하다가 드뎌 제 손으로 직접 테스트 해보게 되었습니다. 비록 완전 새것 상태에서는 바로 테스트를 못한것이 아쉬움이 있지만 그래도 거의 한달간 직접 테스트를 해볼수 있게 되었습니다. FAIMS Pro로 장착하여 테스트도 해보았습니다. 몇개로 나누어서 글을 올릴 예정입니다. Exploris는 모양과 크기면에서 Q-Exactive 시리즈와 유사한 Orbitrap Fusion과 친척입니다. 그래서 Orbitrap Fusion에서 사용하던 FAIMS나 EasySpray Source를 호환하여 사용할수 있습니다. 이전글에 QE-HF Benchmark에 관한 내용을 적었듯이 Exploris 480 장비도 차후 Maintenance 를 위해 B.. 2021. 6. 28. C18 컬럼에서 펩타이드가 분리되는 과정 펩타이드는 어떻게 C18 컬럼을 통과하면서 분리가 되는걸까요? 요즘은 모든 장비가 자동화가 되어 있어서 크로마토그래피 이론을 잘 알지 못해도 실험하는데 큰 문제가 없습니다. 펩타이드의 분리조건은 보편적으로 사용하는 방법을 사용하면 됩니다. 하지만 크로마토그래피의 원리를 잘 알게되면 장비에 문제가 있거나 일반적이지 않은 시료를 분리할때 도움이 되곤합니다. 펩타이드가 컬럼에 들어가면 이동상인 H2O+Acetonitrile 와 컬럼의 정지상인 C18에 맞닥뜨리게 됩니다. 이때 펩타이드는 자신이 좋아하는 성질에 더 오래 머물게 됩니다. hydrophobic 한 펩타이드는 대부분 hydrophobic한 C18에 결합되게 됩니다. 유유상종의 개념입니다. 하지만 뒤에서 펌프의 강력한 힘으로 이동상을 보내면서 둘 사이.. 2021. 6. 27. DIA와 DDA에서 Replicate 수의 증가에 따른 검출 단백질수의 변화 DIA 데이타를 Spectronaut로 분석할때 시료의 수가 증가되면 개별적인 시료의 검출단백질수가 증가되는지 확인해보았습니다. DDA분석를 이용한 Label-free Quantitation (LFQ)분석시 MaxQaunt에서는 Match-to-run 이나 Proteome Discoverer Feature map/Minora Feature Detector 기능이 있습니다. 이 기능은 특정 시료에서 MS/MS가 수행되지 않더라도 다른 시료에서 유사한 Retention timer과 동일한 Precursor ion에 대한 MS/MS 결과 있다면 검출된것으로 고려됩니다. 즉 이기능을 이용하면 분석하는 시료의 수가 증가될때 개별적으로 검출되는 단백질의 수도 조금씩 증가되는 경향이 있습니다. DDA 분석에서 mis.. 2021. 6. 17. 이전 1 ··· 31 32 33 34 35 36 37 ··· 61 다음
