프로테오믹스(단백체학)362 특정 소수의 단백질로 인해 TMT Phosphopetide 정량분석의 어려움 조직에 따라서 소수의 특정 종류의 단백질들이 전체 단백질에서 많은 양을 차지 하는 경우가 있습니다. 이 경우 단백질의 정성과 정량분석에 어려움이 있습니다. 몇년전에 쥐의 다리 근육조직을 이용하여 TMT 정량분석을 하였습니다. 서로다른 조건에서 반복실험해서 얻은 8개의 Tibialis anterior (경골앞면?) 조직으로 TMT 정량분석을 수행하였습니다. 단백질의 전체 정량분석과 더불어 TiO2를 이용하여 Phosphorylation의 변화를 동시에 측정하였습니다. 검출된 단백질과 펩타이드의 수는 아래와 같습니다. 일반적으로 검출되는 단백질의 수인 4,000~5000개의 단백질수에 못미치는 숫자입니다. 이유는 다음과 같습니다. 특별히 근육수축을 담당하는 단백질중에 Titin이라는 한개의 단백질 양에서 많.. 2021. 5. 15. 96-well plate C18 컬럼을 이용한 펩타이드 전처리 이전글에서 harvard apparatus 사의 C18 stage-tip 의 효율성을 보았습니다. 이전글] C18 Reverse Phase Chromatography SpinColumns (Harvard Apparatus)을 이용한 펩타이드 전처리 이번에는 동일한 회사의 제품이지만 96-well plate 형태로 된 것을 테스트해보았습니다. 많은 수의 시료를 동시에 전처리할때 아주 유용합니다. 테스트에서 중점을 두는것은 시료가 loading 및 Washing 과정에서 펩타이드의 손실이 없어야 한다는것입니다. 효율이 낮은 컬럼의 경우 loading과정에서 많은 펩타이드들이 C18에 결합하지 않고 용리됩니다. 두가지 서로 다른 용량(Micro and Macro)을 가지는 Plate를 사용하였습니다. Vacu.. 2021. 5. 12. 짧은 LC gradient로 단일단백질 검출하기 IP 시료와 같이 단일 단백질 혹은 소수의 단백질이 포함된 시료의 경우 굳이 긴 LC gradient를 사용하지 않아도 됩니다. 물론 장비의 시간에 제한이 없을 경우는 상관없습니다. 하지만 시료의 수가 많고 장비의 시간에 제한이 있을 경우 원하는 단백질을 확인하는 수준이라면 짧은 LC gradient로도 충분합니다. 일반적으로 원하는 단백질을 검출하기 위해서 IP를 수행합니다. 이때 100% 단일 단백질만이 회수되지는 않습니다. 하지만 만약 IP가 잘 수행되었다면 시료의 대부분이 목표단백질이 차지할것이며 나머지 소량의 단백질이 포함되어 있을것입니다. SigmaAldrich에서 판매하는 BSA power를 in-solution digestion하여 분석해보았습니다. 보통 판매되는 이러한 단백질은 순도가 1.. 2021. 5. 10. 유사한 m/z 펩타이드가 유사한 시간에 용리될때 구분하는 방법 m/z 가 유사한 precursor ion이 거의 동일한 시간대에 용리된다면 이 두 펩타이드를 구분하는데 약간의 주의가 필요합니다. 앞의 글에서 나온 BSA의 SLGKVTR을 예로 들어 보겠습니다. SLGKVTR의 경우 이론적인 m/z 값은 409.2482 입니다. MS1 spectrum 에서 비록 intensity 가 낮지만 아래의 스펙트럼에서와 같이 m/z 409.2479 ( -0.7 ppm)가 검출되었습니다. 앞에서 글에서 볼수 있듯이 이 펩타이드에 대한 MS2 스펙트럼을 얻기 위해서 PRM을 수행하였습니다. 아래는 m/z 409.2482에 대한 MS1 XIC와 PRM MS2 스펙트럼을 보여줍니다. m/z 409.2482에 대한 MS1 과 MS2의 피크의 시간이 차이가 납니다. m/z 409.248.. 2021. 5. 8. Abnormal background peaks 를 통해 장비 상태확인 및 조치하기 우리는 종종 장비상태에 대해서 큰 신경을 쓰지 않고 분석하는 경우가 많습니다. 그리고 앞의 사람이 이상없이 사용했다면 그냥 바로 본인의 시료를 분석하게 됩니다. 특별히 시료가 아주 많을때는 더욱 그렇습니다. 얼마전에 발견한 현상입니다. QC 시료인 BSA 크로마토그램입니다. 전반적으로 좋아보입니다. 하지만 전반부의 크로마토그램을 자세히 보면 일반적으로 보이는 background peak들이 전혀 보이지 않습니다. 이럴때 보통 Spray가 좋지 않기 때문이라고 생각합니다. 하지만 카메라를 통해서 Spray는 이상이 없다는것을 알수 있습니다. 중간에 피크들이 나오고 있기 때문에 크게 상관없다고 생각합니다. 아래 크로마토그램은 이전에 분석한 BSA 크로마토그램입니다. Background가 정상적으로 보입니다... 2021. 5. 7. Fixed First mass 값에 따른 단백질 및 펩타이드 수 비교 Q-Exactive series에는 Fixed First mass 기능이 있습니다. Precursor ion의 m/z에 상관없이 first m/z를 고정할수 있으며 Dynamic을 방식으로 precursor ion에 따라 자동적으로 달라지는 형태가 있습니다. 보통 고정된 값을 사용할때는 m/z 100을 사용합니다. 일반적으로 가장 많이 사용하는 tryptic digestion을 하게 되면 y1은 K (m/z 147) 나 R (m/z 175)이 됩니다. 분자량이 적은 immonium ion 을 검출하기 위해서는 First mass 값을 이렇게 100 혹은 50 으로 낮은 값으로 고정을 하는것이 좋습니다. 하지만 실제로 database 검색시 얼마나 효과가 있을지는 모르겠습니다. 프로그램에 따라 immoni.. 2021. 5. 7. 이전 1 ··· 33 34 35 36 37 38 39 ··· 61 다음
