프로테오믹스(단백체학)362 Capillary Polishing station (ESI Source solutions) Nano LC system에서 Fused silica capillary tubing 을 여러 용도로 사용합니다. 그중에서도 컬럼을 만들어서 충진할때 가장 많이 사용합니다. 또한 nano-LC 시스템에서의 connection을 위한 tubing으로도 주로 사용합니다. 요즘은 nano-LC 시스템이 고압력을 견딜수있는 UPLC 시스템이라서 Viper tubing(Thermo)같이 고압력에서 잘 견딜수 있는 상용화된 tubing을 사용합니다. 하지만 Tubing은 아주 고가임이깨 일반적인 실험실에서는 쉽게 구매해서 사용하지 못할때가 있습니다. 이럴때는 부득이하게 Fused silica capillary tubing을 적당한 길이로 절단하여 사용합니다. Nano 컬럼이나 시스템 연결용 Tubing으로 사용하기 .. 2021. 6. 15. Thermo Q-Exactive HF benchmark Experiments 오래전에 Refurbished QE-HF를 설치한후 Benchmark 실험을 한 데이타를 정리하여 보았습니다. 비록 완전 새것은 아니지만 특별히 장비에 문제가 없는 상태에서 구입을 하였습니다. 장비가 설치되면 Reference 를 위해서 데이타를 수집해놓습니다. 차후 문제가 생겼을때 Reference 데이타를 참고로 장비 상태를 확인할수 있습니다. 또한 업체에 문제여부를 크레임할때로 유용합니다. Standard BSA Standard BSA를 이용하여 30min gradient 로 DDA를 수행합니다. Sequence coverage와 검출된 펩타이드 수를 확인합니다. 검색 프로그램에 따라 데이타가 달라짐으로 가능한 동일한 프로그램에서 동일한 검색조건을 사용합니다. 아래는 20 fmol BSA에 대한 크.. 2021. 6. 14. Precursor ion이 충분히 fragmentation 되지 않는 경우 보통 Q-Exactive 시리즈에서는 HCD fragmentation을 위한 NCE값을 27정도로 설정합니다. 이유는 정확히 모르겠지만 가끔씩 Precursor ion이 충분히 fragmentation이 되지 않고 MS2에 상당한 양으로 남아있는 경우가 있다. 아마 fragmentation을 담당하는 장비 부분이 오염이 되었거나 혹은 충분히 최적화가 안되어서 그럴것입니다. 이러한 이유로 가끔씩은 MS2 스펙트럼을 수작업으로 체크해야 할 필요가 있습니다. 최근에 BSA 결과에서 precursor ion이 MS2에 상당한 많이 남아 있는것을 발견하였습니다. 하지만 단백질을 검출하는데는 큰 문제는 되는않습니다. 만약 기존의 결과에 비해서 전반적으로 MS2 스펙트럼에 precursor ion이 남이 남아있다면 .. 2021. 6. 2. 정량분석에 있어서 신뢰값에 대한 시료수와 fold-change 값의 관계 질량분석기를 이용하여 정량분석후 확연하게 차이나는 단백질이 보이면 아주 기분이 좋습니다. 이러한 상대적인 차이가 시료전처리 과정에서 생긴 오류가 아니라 실제적인 단백질의 변화에 따른 차이임을 바라게 됩니다. 질량분석기 기반으로 정량분석시에는 단백질을 바로 측정하는것이 아니라 여러 과정을 거쳐서 펩타이드를 분석합니다. 이로인해 Protein extraction, Digestion, clean-up, or fractionation등의 과정에서 시료 손실은 피할수 없습니다. 만약 두개의 시료만으로 분석하여 2배차이나는 단백질을 찾았다고 하면 아무도 믿어주지 않을것입니다. 그렇다고 초기 단계에서 수백개의 시료를 분석할수도 없습니다. 시료수가 많아지게 되면 또한 변수도 많아질수도 있습니다. 만약 시료전처리과정에서.. 2021. 5. 27. Stage-tip hpRP fractionation with the limited amount of phosphopeptides Phosphopeptides 분석에 있어서 다양한 전략이 있습니다. 보통 처음 시료의 양에 따라 실험자가 선호하는 방법이 있습니다. 만약 시료의 양이 많을 경우 Digestion후 펩타이드를 분획하여 각 분획을 TiO2등으로 enrichment 합니다. 이렇게 할 경우 최대한 많은 phosphopeptide를 검출 할 수 있습니다. 하지만 시료의 양이 제한되어 있다면 분획후 TiO2를 수행하는 과정에서 시료의 손실이 있게 됩니다. 전체 펩타이드에서 Phosphopeptide가 차지하는 비율이 적기 때문에 최종 회수되는 양은 많지 않을것이라 예상할 수 있습니다. 그래서 TiO2후 얻어진 phosphopeptide를 바로 질량분석기로 분석할수 있습니다. 또한 TiO2 분획후 micro-scale로 다시 분획.. 2021. 5. 26. Targeted Mass trigger를 이용한 Lysine Acetylated 펩타이드 구조분석 Lysine acetylation 펩타이드의 경우 MS/MS에 특정한 immonium ion이 생성됩니다. Acetyllysine의 Immonium ion 인 143.1179 Da 과 ammonia가 떨어진 형태이 126.0913 Da 이 생성됩니다. 이것은 Acetyl lysine 을 확인하는데 Diagnostic ion 으로써 사용될수 있습니다. Orbitrap Fusion의 경우 MS2 스펙트럼에서 Diagnostic ion이 발견되면 ETD와 같은 추가적인 분석을 수행할수 있습니다. Targeted mass Trigger 기능을 이용하면 됩니다. Diagnostic ion 인 126.0913 Da 에 대해서 Targeted Mass Trigger 를 설정하면 MS2 스펙트럼에서 m/z 126.09.. 2021. 5. 22. 이전 1 ··· 32 33 34 35 36 37 38 ··· 61 다음
