프로테오믹스(단백체학)362 Dynamic exclusion time 에 따른 단백질 및 펩타이드 검출수 비교 Dynamic exclusion time은 complex 시료에서 최대한 많은 펩타이드를 검출하기 위해 설정합니다. DDA 분석에서 Intensity가 높은 펩타이드가 존재할 경우 주위에 낮은 intensty를 가지는 펩타이드가 MS/MS가 수행되지 않고 넘어가는것을 방지하기 위함입니다. 일반적으로 30~60초 정도를 설정합니다. 이렇게 하면 일반 nano LC에서 보통 피크 한개당 한번 혹은 두번정도 MS/MS를 수행하게 됩니다. Promega 사의 Yeast digest standard를 이용하여 서로 다른 Dynamic exclusion time에서 분석하여 단백질 과 펩타이드 수를 비교해 보았습니다. 100 ng을 주입하여 1 hour 와 30 min LC gradient로 각각 Q-Exactiv.. 2021. 5. 3. 실제로 존재하지만 DDA 분석에서 검출되지 않은 펩타이드 확인하기 펩타이드는 존재하지만 다른 펩타이드들과 비교해서 intensity가 낮아서 검출이 되지 않는 경우가 많습니다. Data-dependent acquisition에서 자주 보는 현상입니다. 혹은 MS2가 수행되었지만 MS2의 quality가 낮아서 검색결과에 제외되는 경우도 많습니다. 이럴 경우 실험자는 이 펩타이드를 검출하지 못하는것으로 생각할수 있습니다. 하지만 간단하게 해당 펩타이드의 존재여부를 확인할수 있습니다. 아래는 BSA를 DDA로 분석한 크로마토그램입니다. DB 검색을 통해 약 85% sequence coverage를 얻었습니다. 하지만 표시된것 펩타이드(SLGKVGTR)가 검출이 되지 않았는데 이것의 존재여부를 확인해보고자 합니다. 먼저 이 펩타이드의 m/z에 해당하는 m/z 409.2482.. 2021. 5. 2. Xcalibur Qual browser 에서 Fixed scale로 피크들의 상대적인 높이 비교하기 Labe-free Quantitation 방법으로 정량분석후 상대적인 정량값은 프로그램에서 계산된 값을 사용하여 비교합니다. Large-scale에 의한 정량분석결과를 보게 되면 차이나는 단백질의 수가 상당히 많습니다. 하지만 차이나는 단백질중에 False-positive도 상당히 많이 존재하게 됩니다. 결과에 대한 신뢰성을 높이기 위해서는 차이나는 단백질중 흥미로운 단백질이 발견되면 수작업을 통해 한번더 재확인하는 것이 좋습니다. 이를 위해 Xcalibur Qual Browser를 단백질에 해당하는 대표적인 펩타이드의 Extraction Ion chromatogram(XIC)를 비교하는것입니다. 이때 Fixed scale로 보면 상대적인 차이를 확연하게 비교해볼수있습니다. 예를 들어 아래와 같이 4개의.. 2021. 5. 1. Lysine(K) 과 Arginine(R)에 결합된 Hexose isobaric peptide 의 characterization 앞에서 언급한 펩타이드의 경우 의뢰자는 R, K에 hexos가 결합된 form을 찾고자 하였습니다. C-terminal의 M은 hsl modification (Δm = -48 Da)이 되어 있습니다. DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 관련글] CNBr digestion에 의한 Methionine 의 homoserine lactone modification 이 펩타이드는 두 개의 K와 한개의 R이 존재합니다. 즉 아래와 같이 3가지 isoform이 존재할수 있습니다. DAEFR(Hex)HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM DAEFRHDSGYEVHHQK(Hex)LVFFAEDVGSNKGAIIGLM DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(Hex)GAI.. 2021. 4. 28. CNBr digestion에 의한 Methionine 의 homoserine lactone modification Cyno Bromide(CNBr)를 이용하여 산성 조건에서 Protein digestion시 C-terminal 쪽의 Methionine 이 homoserine lactione (hsl) ( Δm = −48 Da) 로 변형되기도 합니다. Hormoserine (-29.99 Da)이 hydrolysis를 거치게 되어 최종 -48 Da 차이가 나게 됩니다. 반면 염기성 조건에서는 free acid가 형성됩니다. 오래전 CNBr로 digestion된 시료를 분석하게 되었습니다. 의뢰자는 예상하는 펩타이드에 대한 정보를 주었고 검출여부를 확인하고 싶어하였습니다. 펩타이드 sequence는 다음과 같습니다. DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 복잡한 시료가 아니기 때문에 간단히 DDA.. 2021. 4. 27. EnclycopeDIA와 Spectronaut 를 이용한 Human Plasma DIA 분석법 비교 Plasma 시료를 Overlap 방식을 이용한 EnclycopeDIA 프로그램방식과 non-overlap 방식으로 Spectronaunt 프로그램 방식을 분석해보았습니다. High abundant proteinds을 제거하지 않으면 검출되는 단백질의 수는 아주 제한적입니다. Plasma 시료에 대한 관련글은 아래와 같습니다. 관련글 혈액단백질 (Plasma & Serum)의 프로테오믹스 분석의 어려운점 혈액단백질 (Plasma & Serum)의 프로테오믹스 분석의 어려운점 대학원 그리고 박사후 연구원동안 혈액에서의 바이오마커를 검출하는 일을 하였습니다. 혈액은 가장 쉽게 확보할수 있는 생체시료이기에 진단용으로 아주 유용합니다. "한방울의 혈액"으로 많 proteomicstechnology.tistory.. 2021. 4. 26. 이전 1 ··· 34 35 36 37 38 39 40 ··· 61 다음
