프로테오믹스(단백체학)362 150 µm ID (내경) 컬럼의 nano column으로 낮은 압력으로 펩타이드 분리하기 Nano LC를 이용한 펩타이드 분석에서 분리능을 향상시키기 위해서 최대한 사이즈를 줄이고 있습니다. LC 의 성능이 좋아져서 고압력에서도 운영이 가능하기 때문에 C18 material의 사이즈도 5 µm에서 1.9µm로 줄어들었습니다. 또한 Column ID (내경)의 크기도 줄어듭니다. 보통 75 µm ID를 사용하지만 종종 50 µm 도 사용합니다. 이렇게 하여 피크의 분리능을 향상시키면 좋을듯합니다. 하지만 사이즈가 작아짐에 따라 Troubleshooting을 할 경우도 증가됩니다. 얻는 만큼 잃는것도 있습니다. 가끔씩은 마음이 편한 상태로 실험을 하고 싶을 때가 있습니다. 내경이 큰 컬럼을 사용할 경우 시스템의 압력도 줄어들고 flow-rate도 상대적으로 많이 증가시킬수 있어서 여러모로 편할수.. 2021. 3. 27. Orbitrap Fusion의 MS2-MS3를 이용한 DSSO crosslinking 펩타이드 검출방법 이번에는 DSSO를 이용하여 crosslinking된 시료를 Orbitrap Fusion 의 MS2-MS3방식을 이용하여 검출한뒤 Proteome Discoverer로 검색된 결과를 살펴보겠습니다. 앞에서 Fusion MS2-MS3 방법과 Proteome Discoverer 검색 방법을 설명하였습니다. 관련글 DSSO crosslinking 펩타이드 분석을 위한 Proteome Discoverer- XlinkX 검색 설정방법 DSSO (disuccinimidyl sulfoxide) Crosslinking (XL-MS) 펩타이드 분석 (BSA+Cytochrome C) Peptide Identification 먼저 Xlinxk Filter에서 Peptide로 설정된 부분에서 검춝된 펩타이드의 리스트를 보여주.. 2021. 3. 25. DSSO crosslinking 펩타이드 분석을 위한 Proteome Discoverer- XlinkX 검색 설정방법 DSSO Crosslinking 펩타이드를 Orbitrap Fusion에서 MS3 방법으로 얻은 데이타를 Prteome Discoverer 에서 검색하기 위한 workflow입니다. Process Workflow Process workflow의 전체적인 절차는 아래와 같습니다. DSSO로 반응시킨 시료에는 DSSO가 결합된 펩타이드와 함께 결합되지 않은 일반 펩타이드가 존재합니다. 그래서 검색시 이 두 가지 펩타이드를 모두 검출하는 workflow가 필요합니다. 앞 단계는 동일하지만 XlinkX detector에서 Use MS(n-1) with Parent Precursor로 설정합니다 Crosslink Modification은 DSS/+158.005 Da를 설정합니다. Xlinxk Filter 에서는 .. 2021. 3. 25. DSSO (disuccinimidyl sulfoxide) Crosslinking 펩타이드 분석을 위한 Orbitrap Fusion MS3 Method 설정 MS2-MS3 를 이용한 분석 Orbitrap Fusion에서의 Method는 아래와 같습니다. 요약하자면 CID fragmentation을 이용하여 전형적인 DSSO 피크를 찾습니다. 두개의 피크가 31.9721 Da 차이가 나는 MS2 스펙트럼이 있을 경우 각 두개의 피크에 대해서 MS3를 수행합니다. DSSO crosslinking 펩타이드만을 최대한 검출하기 위해서는 MS1에서 피크를 선택할때 2+는 제외하고 3-6로 설정하기도 합니다. 보통 crosslinking 된 펩타이드의 경우 높은 전하를 가집니다. 즉 일반적인 2+ 펩타이드에 의해서 검출기회를 놓칠수 있기 때문에 2+ 펩타이드는 제외시키는것이 좋습니다. ddMS2 OT CID는 아래와 같습니다. 정확히 31.9721 Da (10ppm 이.. 2021. 3. 23. TMT 정량분석에서 Proteome Discoverer의 Co-isolation threshold 값의 효과 TMT 를 이용한 정량분석에서 LC에서 용리된 유사한 m/z 를 가지는 이웃 펩타이드의 co-fragmentation으로 인해 TMT 정량분석에 정확도가 떨어진다고 알려져 있습니다. 아래 관련글 참조 이러한 문제점을 해결하기 위해서 Orbitrap Fusion을 이용하여 Multi-notch (SPS) MS3를 수행합니다. 하지만 Q-Exactive 시리즈와 같은 장비는 MS3가 불가능합니다. 이전글에서도 보듯이 MS2 방식에서는 얻어진 상대적인 정량값은 실제 값과 많이 차이가 납니다(아래 관련글 참조). Co-isolation Threshold Proteome Discoverer 의 검색에서 이러한 문제를 어느정도 해결할수 있는지 확인보았습니다. Reporter ions 정량분석을 위한 Consensu.. 2021. 3. 22. 혈액단백질 (Plasma & Serum)의 프로테오믹스 분석의 어려운점 대학원 그리고 박사후 연구원동안 혈액에서의 바이오마커를 검출하는 일을 하였습니다. 혈액은 가장 쉽게 확보할수 있는 생체시료이기에 진단용으로 아주 유용합니다. "한방울의 혈액"으로 많은 질병을 진단할수있는것이 많은 연구자들이 가지는 목표일것입니다 혈액 특히 Plasma 나 Serum을 프로테오믹스로 분석하는데 있어서 실제 실험실에서 겪는 어려운점을 적어볼까 합니다. 소수의 단백질이 혈액단백질의 거의 90% 이상을 차지함으로 나머지 중요한 단백질이 검출되지 어렵다는 점은 대부분 알고 있을것같습니다. 1. High abundant proteins 의 양적 차이에 따른 low abundant proteins의 단백질양의 큰 변화 적은 수의 High abundant proteins (e.g, Albumin)의 함.. 2021. 3. 18. 이전 1 ··· 37 38 39 40 41 42 43 ··· 61 다음
