프로테오믹스(단백체학)362 SDS buffer가 들어간 펩타이드 분석 (실패경험) 얼마전에 시료에 SDS buffer가 있다는 사실을 깜박하고 분석을 하였습니다. 시그널이 나오지 않아서 시료의 문제나 혹은 시료 전처리 과정에서 실수가 있다고 생각하였습니다. 상대적으로 complex 한 시료임에도 불구하고 아래와 같은 크로마토그램이 나왔습니다. 보이는 피크들은 모두 Single charge를 가지는 chemical 혹은 background peak들입니다. Trion X-100과 같은 detergent가 시료에 존재할 경우 아래 그림과 같이 크로마토그램에서 구별가능한 피크들이 보이게 마련입니다. 하지만 SDS가 존재할 경우 ion suppression으로 인해 피크들이 아예보이지 않게 됩니다. https://en.wikipedia.org/wiki/Ion_suppression_in_liq.. 2021. 3. 4. Data-dependent Acqusition에서 Gas-phase fractionation의 효율성 오래전 질량분석기 장비는 지금과 같이 빠른 속도를 가지지 못했습니다. 한때 Gas-phase Fractionation이라는 방법으로 통해 보다 많은 단백질/펩타이드를 검출하려고 했습니다. Gas-Phase Fractionaton은 일반적인 물리적 분획(e.g, SCX and HILIC)과는 다르게 질량분석기안에서 이루어집니다. 일반적인 프로테오믹스 분석에서는 질량분석기의 Full scan range를 m/z 300-1200로 설정하여 data-dependent acquisition(DDA)로 피크가 높은순으로 펩타이드를 검출합니다. ESI 스펙트럼은 가장 높은 피크를 100으로 두고 나머지는 상대적인 값으로 보여집니다. 즉 주위에 큰 피크의 높이에 따라 나머지 높이가 낮은 펩타이드의 상대적인 높이가 달라.. 2021. 2. 28. Thermo Easy-Spray Source 와 column (50 cm, 25cm)을 이용한 펩타이드 분리 오래전에 Thermo 사의 Easy-Spray Source 와 Easy-Spray column을 구매하였으나 별로 사용하지 않았습니다. 실험실에서 충진해서 쓰는 컬럼으로도 분석서비스를 하는데는 큰 문제가 없습니다. 컬럼 한개가 $1,000불이 넘는걸 감안하며 몇불도 안되는 단가의 직접 충전한 컬럼이 여러모로 유용하다고 생각했습니다. 하지만 프로젝트에 따라 Easy-Spray Source 와 Easy-Spray column을 사용해야할 일이 있을듯합니다. 특별히 직접 컬럼을 만들고 사전에 테스트하는 번거로운 작업을 없앨수 있을것 같습니다. 나의 노동력 시간이 컬럼만드는데 사용하는 시간보다 더 가치있다고 생각이 들어야 될것 같습니다. 50 cm 와 25cm Easy-Spray Column 비교 50 cm 와.. 2021. 2. 26. Thermo high-flow Vanquish UPLC 와 TSQ Altis™ Triple Quadrupole을 이용하여 20 분내에 소량 단백질의 정량분석 정량분석을 수행할때 검출감도를 최대한 높이기 위해서 nano UPLC를 사용합니다. 하지만 nano UPLC의 경우 감도가 높은 반면 troubleshooting이 많다는 단점이 있습니다. 요즘은 정량분석을 위해서는 고분해능, 고감도 질량분석기로 인해 정량분석시 PRM분석을 많이 합니다. 이때 보통 nano UPLC를 사용합니다. 2년전에 설치된 Thermo 사의 High-flow UPLC인 Vanquish 와 TSQ Altis™ Triple Quadrupole를 이용하여 nano UPLC에서 사용하는 정도의 단백질 양으로 정량분석을 해보았습니다 (이전에 쓴 글에 대한 업데이트입니다). 기존의 nano UPLC을 이용한 PRM 분석법에 대략 비교를 할수 있을것 같습니다. 장비는 아래와 같습니다. 컬럼은 .. 2021. 2. 25. Chymotrypsin의 "Semi" cleavage 를 이용한 단백질 검출 II 이전 글에 작성된 Chymotrypsin 처리후 데이타베이스 검색시 “Semi” digestion으로 검색하면 추가적인 펩타이드를 검출할수 있음을 설명하였습니다. 한번 더 확인차 BSA standard 를 이용하여 다시 실험을 하였습니다. BSA standard를 Chymotrypsin을 처리후 질량분석기로 검출하였습니다. Raw 파일을 Proteome discoverer 2.4에서 BSA fasta 파일을 이용하여 Chymotrypsin Full 과 Semi로 각각 검색하였습니다. 아래는 검색결과입니다. Sequence Coverage는 예상대로 “Semi” 검색에서 약간 높습니다. 하지만 검출된 펩타이드의 갯수는 월등히 높습니다. "Full"에서는 108개가 검출된 반면 "Semi"에서는 401개가 .. 2021. 2. 25. Online SCX trap column 을 이용한 online 2D-LC fractionation 요즘은 소량의 펩타이드를 분획하는 방법이 많이 소개되어 있습니다. 보통 Stage-tip 기반으로 소량의 펩타이드를 분획한 후 질량분석기로 측정합니다. 하지만 가끔씩 이러한 offline 분획이 귀찮을때도 있습니다. SCX 분획은 Salt를 사용하기 때문에 분획후 clean-up 과정이 요구될때도 있습니다. 이때는 각 분획은 하나씩 C18 컬럼으로 clean-up을 해야 됩니다. 이런 과정이 없이 소량의 시료를 SCX로 간단히 분획하여 분석하고 싶을 때는 Online SCX컬럼이 유용합니다. 이전에 한국에서 사용하던 (거의 7~8년이 된것 같네요) SCX trap이 있어서 Ultimate 3000 Dionex LC 에 장착하여 테스트를 해보았습니다. 사용한 컬럼은 아래 그림과 같이 Waters 사에서 구.. 2021. 2. 23. 이전 1 ··· 39 40 41 42 43 44 45 ··· 61 다음
