프로테오믹스(단백체학)362 사람 변 (Stool samples)에서의 human proteome 분석의 어려움 처음으로 사람의 변(똥)으로 분석을 하였습니다. 변에 존재하는 미생물에서 생성되는 펩타이드로 인해 human proteome만을 선택적으로 검출하는것이 어렵습니다. 이렇게 microbiome을 사전에 제거하는 과정이 있다면 분석이 쉬울것입니다. 하지만 사람의 변에서는 그러한 과정이 쉽지 않을것입니다. 일단 어떤 형태로 검출이되는지 간단히 직접 실험을 해보았습니다. 병원에서 받은 시료를 간단한 DDA 방법으로 분석한후 검색을 하였습니다. 5명의 시료를 일반적인 방법으로 단백질을 추출후 Q-Exactive ( DDA, 60 min LC gradient )로 분석하였습니다. ●Human Stool samples 5명의 시료에 해당하는 크로마토그램입니다. Complex 시료에서 볼수있는 전형적인 크로마토그램입니.. 2021. 4. 4. HCD와 EThcD에서의 단백질 및 펩타이드 검출수 비교 ETD는 일반적을 bottom-up 분석에는 잘 사용하지 않습니다. 특정한 용도로만 쓰이는 경우가 많습니다. ETD에서의 발생하는 단점들을 보완할수 있는 EThcD도 여러 특정한 용도로 사용되고 있습니다. 하지만 기술적으로는 일반 단백질분석에 있어서 검출수를 고려하면 HCD 에 비해서 효율이 떨어질것이라 생각됩니다. 질량분석기가 ETD를 수행하기 위해서는 HCD보다는 많은 시간을 할애해야 합니다. 검출수에 있어서 대략 어느정도 차이가 나는지 확인해보았습니다. 100ng Yeast digest standards를 이용하여 HCD와 EThCD (Supplemental activation 15 and 25)에서의 단백질과 펩타이드 수를 비교해보았습니다. 아래 그래프에서 보듯이 예상대로 EThcD의 검출수는 H.. 2021. 4. 2. Orbitrap Fusion의 Intensity Thresold값에 따른 Yeast Protein digestions의 단백질/펩타이드 검출수 비교 펩타이드 검출에 있어서 Intensity Thresold 값이 어떻게 영향을 주는지 BSA 를 통해 살펴보았습니다. 이번에는 보다 complex한 yeast protein digest 를 이용하여 단백질 과 펩타이드의 수가 어떻게 달라지는지 테스트해보았습니다..또한 두개의 서로 다른 양 (10ng 과 100ng)에서의 차이점도 알아보았습니다. 5가지의 서로 다른 intensity thresold값 ( 5E3, 1E4, 5E4, 1E5, 5E5) 에서 10ng, 100ng Yeast protein digest를 각각 분석하였습니다. 아래 그래프는 100ng에서 검출된 단백질 및 펩타이드 수에 대한 비교입니다. 5E3에서 5E4까지는 큰 변화가 없지만 5E5에서 상당히 줄어듭니다. 많은 펩타이드의 inten.. 2021. 4. 1. TMT MS2 와 MS3 방법에서의 단백질 검출수 비교 이전 글에서 TMT분석에 있어서 MS2 분석법이 가져 올수 있는 ratio suppression에 대해서 이야기를 하였습니다. 이러한 이유로 MS3 방법을 종종 사용합니다. 하지만 MS3 분석법을 꺼리는것 중 하나가 아마 상대적으로 검출되는 단백질의 수가 적기 때문이 아닐까 합니다.이론적으로도 MS2한번만으로 얻는결과와 MS2-MS3를 수행해서 얻는 결과에서는 검출되는 단백질의 수에 차이가 있을수 밖에 없을 것 같습니다. 물론 더 많은 분획을 하는등 추가적인 과정을 거친다면 MS2와 유사한 수의 단백질을 검출할수 있을 것입니다. 이번에는 단순히 TMT가 labeling이 되지 않은 Yeast protein digests standard를 이용하여 TMT MS2 와 TMT MS2-MS3방법으로 분석한후 검.. 2021. 3. 31. Commercial Target protein 구매를 통한 PRM 분석 최적화 상대적인 정량분석을 통해 얻은 결과중에 흥미로운 단백질이 발견되면 그 특정 단백질만을 이용하여 다시 정량분석을 하게 됩니다. 이때 보통 PRM과 같은 Targeted assay를 합니다. 다음단계로 가기 위해서는 보통 standard synthetic peptides가 필요할 경우가 많습니다. 검출된 단백질에 해당하는 펩타이드중에 가장 좋은 펩타이드를 몇개 골라서 합성을 의뢰합니다. 조금더 최적화를 위해서 저렴한 순도가 낮은 light 펩타이드를 먼저 합성하여 실험을 하는 경우도 있습니다. 또한 이미 발견된 펩타이드가 있기 때문에 보통 heavy isotope 펩타이드를 의뢰합니다. 하지만 해당 단백질를 업체를 통해 저렴하게 구할수 있으면 단백질 자체를 구매하는것이 여러모로 좋을때가 있습니다. 단백질 자.. 2021. 3. 31. Radio frequency (RF) Lens(%) 값에 따른 서로 다른 m/z 이온들의 감도 변화 장비의 모든 파라미터를 이해하고 실험하지는 않습니다. 결과에 특별히 영향을 주지 않으면 다른 사람들이 써오든 파라미터를 쓰게 됩니다. 하지만 특별한 분석을 할때 약간이 파마미터의 변화를 주게 되면 조금더 좋은 데이타를 얻을수 있습니다. Radio frequency (RF) Lens(%)값이 있습니다. 이온들을 통과시킬때 영향을 주는 파라미터입니다. . 보통 기본값이 60%로 되어 있습니다. 이 값을 변화시키면 scan 과정에서 검출되는 m/z 피크들의 상대적인 intensity가 변화게 됩니다. RF 값을 변화시키면 서로 다른 m/z값을 가지는 이온들의 intensity가 달라집니다. Ion transmission 의 efficiency가 약간씩 달라진다고 알고 있습니다. RF값이 증가될수록 높은 m/z.. 2021. 3. 28. 이전 1 ··· 36 37 38 39 40 41 42 ··· 61 다음
