프로테오믹스(단백체학)362 Microbiome 이 제거된 Mouse stool samples 에서 proteome 분석 이전에 사람의 변에서 단백질을 검출해보았습니다 (이전글). 최근에 쥐의 변 시료를 분석할 기회가 있었습니다. 이번에는 사람의 변 시료와는 다르게 microbiome이 제거된 시료도 포함되어있었습니다. Data-Dependent Acquisition 아래는 microbiome이 제거된 시료와 포함된 시료를 DDA로 3번씩 분석하였습니다. 아래는 대표적인 크로마토그램입니다. 아래는 3번의 반복실험에서 얻어진 단백질과 펩타이드수에 대한 그래프입니다. 예상대로 Microbiome이 제거된 시료에서 더 많은 수의 단백질과 펩타이드가 검출되었습니다. 사람의 시료에서 사용했던 gut microbiome DB로 각각 분석을 해보았습니다. 흥미로운것은 microbiome이 제거된 시료에서는 gut microbial 단백.. 2021. 4. 24. Proteinase K and Pepsin Digestion with BSA standard 질량분석전 Protein digestion에서 Proteinase K 나 Pepsin 는 거의 사용하지 않습니다. 하지만 특정 펩타이드를 검출시 일반적인 enzyme (e.g, Trypsin. Lys-C, chymotrypsin등)이 적절치 않을때 사용될수 있습니다. 실제 실험에는 사용한적이 없지만 차후 실험을 위해서 BSA로 테스트를 해보았습니다. Tryspin, Proteinase K, Pepsin으로 각각 BSA를 Digestion하였습니다. Pepsin digestion은 pH3에서 수행하였습니다. 아래는 3가지 서로 다른 enzyme (Trypsin, Proteinase K, Pepsin)에 대한 BSA의 Base-peak chromatogram 입니다. 얻어진 raw파일은 Proteome Di.. 2021. 4. 21. Orbitrap Fusion의 CID 와 HCD fragmentation 비교 Thermo Scientific 장비를 사용하는 분들이라면 대부분 HCD fragmentation을 사용합니다. 하지만 이전의 Iontrap장비인 LCQ나 LTQ와 같은 장비에는 HCD 방식이 없었습니다. 초기 Orbitrap 장비인 Oribtrap XL부터 HCD가 구현이 되었지만 초창기에는 그 효율이 좋지 않아서 여전히 CID를 사용했었습니다. 하지만 요즈음은 특별한 이유가 아니면 CID를 사용하지 않습니다. Q-Exactive 시리즈에는 없지만 Orbitrap Fusion 시리즈에는 iontrap에서 CID가 가능합니다. CID와 HCD의 원리에 대해서는 온라인에서 좋은 자료를 찾을수 있으리라 생각합니다. CID의 경우 "low mass cut-off"라 불리는 1/3 rule이 적용됩니다. 이것은.. 2021. 4. 19. 적은 수의 펩타이를 분석할때 Dynamic exclusion time 설정하기 Dynamic exclusion time은 complex 시료에서 최대한 많은 펩타이드를 검출하기 위해 설정하는 파마미터입니다. Intensity가 높은 펩타이드가 존재할 경우 이 펩타이드만 계속적으로 검출이되어 주위에 낮은 intensty를 가지는 펩타이드가 검출이 되지 않는것을 방지하기 위함입니다. Dynamic exclusion time은 보통 LC peak의 넓이에 따라 조절 합니다. 일반적으로 30~60초 정도를 설정합니다. 이렇게 하면 일반 nano LC에서 피크 한개당 보통 한번 혹은 두번정도 MS/MS를 수행하게 됩니다. 하지만 단일 혹은 몇개의 펩타이드를 Data-dependent acquisition 으로 분석할때는 dynamic exclusion time을 짧게 해서 분석합니다. 이 .. 2021. 4. 15. IP 시료등 단일 단백질에서 Phosphopeptides 검출시 TiO2 enrichment 사용여부 특정 단백질에서 Phosphopeptide를 검출하는 방법중 가장 감도가 높은 것은 아마 해당 단백질을 IP등으로 분리한후 질량분석를 측정하는것일 껍니다. 종종 의뢰자들이 IP 후 충분한 양의 단일단백질이 얻어졌음에도 예상되는 phosphoppetide가 검출이 되지 않을 때도 있습니다. 이럴때 TiO2 등의 enrichment를 요청하기도 합니다. 원하는 phoshoppetide를 검출하기 위함이겠지요. 하지만 단일단백질에서 Phosphoppetide가 검출이 되지 않은것은 장비의 감도문제가 원인이 아닐것입니다. TiO2는 large-scale enrichment에 적합합니다. 하지만 IP후에 얻어진 제한된 시료의 양으로 TiO2등을 수행하면 오히려 역효과가 납니다. TiO2 enrichment과정에서.. 2021. 4. 8. Large-scale TMT 정량분석에 있어서 MS2와 MS3 분석법 비교 앞에 글에서 TMT 정량분석에 있어서 MS2와 MS3에 대한 내용이 있습니다. 이번에는 Large-scale로 준비한 시료를 이용하여 비교해보았습니다. 3가지의 서로 다른 조건과 각 조건별 3개의 biological replicates를 가지는 cell lysate를 이용하여 실험을 하였습니다. 10-plex TMT로 labeling을 한후 stage-tip hPRP로 7 fraction을 얻었습니다. Q-Exactive HFX로 MS2를 Orbitrap Fusion2로 MS3 를 수행하였습니다. 각 분획은 2시간 LC gradient를 사용하였습니다. 검출결과는 Proteome discoverer 2.4로 분석하였습니다. Comparision of Protein and Peptide # 아래 그래는 각.. 2021. 4. 7. 이전 1 ··· 35 36 37 38 39 40 41 ··· 61 다음
