프로테오믹스(단백체학)362 Chymotrypsin의 "Semi" cleavage 를 이용한 단백질 검출 I Recombinant proteins의 sequence를 확인하는 의뢰가 들어왔습니다. 아주 명확한 단일 밴드의 Gel 입니다. 분자량이 상대적으로 작은 단백질입니다. Trypsin으로분석한후 단백질을 검출하였지만 C-terminal 영역은 trypsin으로 분석이 불가능하여 chymotrypsin으로 다시 분석하였습니다. 아래는 크로마토그램입니다. 단일 단백질임을 감안하면 좋은 크로마토그램을 얻었습니다. Proteome Discoverer로 분석하였으나 기대와는 달리 단지 4 개의 펩타이드만 검출이 되었습니다. 검출된 펩타이드의 스펙트럼도 좋지 않았습니다. 크로마토그램 상에서 나온 피크들이 해당 단백질이 아니라 다른 단백질일것을 예상하였으나 다른 어느 sequence에서도 검출이 되지 않았습니다. 이번.. 2021. 2. 22. Proteome Discoverer에서 Spectra library 기반 MSPepSearch로 단백질 검색하기 Spectra Library 기반 MSPepSearch Proteome Discoverer에서 Spectra library 을 이용하여 DDA 결과를 분석할수 있습니다. 기존의 검색 엔진인 SEQUEST 나 MASCOT 이 아닌 MSPepSearch를 이용합니다. 기존의 DDA 결과를 통해 검색한 결과를 Spectra library 형태로 만들어 이것을 이용하여 검색합니다. Spectra Library Download and Import Proteome discoverer에서는 기본적으로 human proteome에 대한 Spectra librarary를 다운받을수 있습니다. Proteome Discoverer에서 Spectra libraries->download를 클릭하여 다운받고 싶은 것을 선택하여 .. 2021. 2. 20. DIA분석(QE)에 있어서 m/z 500-900 과 mz 400-1000 검색구간에 따른 결과 차이 요즘은 다시 DIA를 기초부터 공부하는기분입니다. 이론적으로 알고 있거나 논문에 이미 결과가 나와 있더라도 직접 운용하는 장비에서는 어떠한지 확인이 필요하다고 생각합니다. 그리고 결과를 정리해 놓아야 다음에 다른 분석에 적절히 사용할수 있을 것 같습니다. 초기에는 DIA의 분석구간을 m/z 500-900으로 하였습니다. 일반적으로 DDA에서 사용하는 m/z 300-1500 혹은 m/z 400-1200을 사용하지 않은것은 초기 장비의 한계로 인해 최대한 검색 구간을 줄여서 감도를 향상시키기 위함이 었을 것입니다. 많은 논문에서 Q-Exactive series의 초기 모델인 QE의 경우 이렇게 m/z 500-900 구간을 사용했던 것 같습니다. 보통 tryptic peptide의 경우 m/z 500-1000.. 2021. 2. 19. Skyline의 DIA method 설정에서 Window 수와 Optimize window placement 에 따른 비교 분석 (QE-HF) 최근에 많은 수의 시료를 정량분석하는 의뢰가 들어오고 있습니다. 시료의 수가 많을 때는 TMT 분석으로 불가능하기 때문에 DIA 분석을 수행합니다. 기존의 DIA 분석 방법을 그대로 적용하면 되긴 하지만 약간의 설정을 수정하면 더 좋은 결과가 있을지 확인할 필요가 있었습니다. 장비마다 성능이 다르기 때문에 동일한 파라미터를 여러 장비 (예, QE, QE-HF, QE-HFX) 일괄적으로 적용하기 보다는 약간의 최적화가 필요합니다, DIA 정량분석을 위해서는 대략 10개의 포인트가 요구됩니다. 보통 nano LC LC 피크의 넓이가 25초라고 가정하면 특정한 피크를 2.5초마다 한번씩 scan를 해야 펩타이드당 10개 포인트를 얻을수 있습니다. Resolution 및 Maximum injection time.. 2021. 2. 18. 적은수의 펩타이드를 정량분석에 있어서 PRM과 DIA 분석법 비교 질량분석기를 이용하여 혼합시료에서 적은수의 펩타이드를 선택적으로 정량분석하는데 있어서는 PRM 방식이 가장 효율적인고 감도가 좋습니다. 동일한 시료를 이용하여 DIA로 정량분석을 한후 PRM 결과와 비교분석을 해보았습니다. 몇가지의 Target 펩타이드를 정량분석하는 분석의뢰가 들어왔을때 기존의 DIA 방법으로 진행해도 되는지 확인해보고 싶었습니다. DIA 결과는 다른 펩타이드의 정보도 함께 포함되기 때문에 차후에 다른 용도로도 사용될수 있기 때문입니다. 테스트를 위해서 293T cell lysate 시료 1 µg당 Ovalbumin 을 2.5, 50, 100ng으로 혼합하여 분석하였습니다. PRM의 경우 먼저 unscheduled PRM을 수행한후 scheduled PRM 으로 분석하였습니다. 대표적인.. 2021. 2. 17. 10-Plex TMT로 Phosphopeptides 검출에 있어서 Sequest HT 와 MS Amanda 2.0 비교 10-plex TMT를 이용하여 phosphopeptide의 정량분석에 있어서 Sequest HT 와 MS Amanda 2.0을 비교해보았습니다. 보통 개발자들이 산출한 결과를 잘 믿지 않고 실제 분석시료로 직접 결과를 내어서 확인을 하는 편입니다. 이전에 분석서비스에 사용했던 결과를 사용하였습니다. 10-Plex TMT가 labeling 시료를 TiO2와 Ti-IMAC으로 Phosphopeptide를 회수하여 얻은 결과입니다. Proteome Discoverer 2.4에서 Sequest HT, MS Amanda 2.0 그리고 Sequest HT+MS Anandma 2.0 으로 각각 분석하였습니다. 아래는 각각에서 검출된 전체 단백질, 전체 펩타이드, 그리고 인산화 펩타이드 수를 비교한 그래프입니다. 검.. 2021. 2. 14. 이전 1 ··· 40 41 42 43 44 45 46 ··· 61 다음
