프로테오믹스(단백체학)362 Exploris 480의 Single-cell DDA Method 테스트 Exploris 480에 설치된 S/W에서는 유저들이 특정한 실험목적에 맞게 사용할수 있는 Method들이 포함되어 있습니다. 그중에 Single-cell proteomics에 사용할수 있는 method가 있습니다. 극미량의 단백질을 검출할수 있도록 감도면에서 최적화시켰다고 생각합니다. 해당하는 단백질의 양이 어느정도인지는 모르겠으나 아마 1ng 이하정도가 아닐까 생각합니다. 낮은 양의 단백질시료에서 검출효율을 보기 위해서 간단히 테스트를 해보았습니다. 1ng 과 10ng에 해당하는 HeLa digestion standard 을 이용하여 기존의 방법과 S/W에서 제공하는 방법으로 분석해 보았습니다. 아래는 각각에서 검출된 단백질과 펩타이드의 수입니다. 예상과는 달리 기존의 방법에서 더 많은 단백질과 펩타.. 2021. 7. 14. PRM으로 HeLa digestion에서 BSA 펩타이드 검출하기 시스템의 상태를 체크할때 각자 실험실 마다 다양한 방법이 있습니다. 대표적으로 BSA standard digest를 사용합니다. 또한 HeLa digestion과 같은 complex한 시료도 사용하기도 합니다. Human cell type인 HeLa digestion에는 BSA 해당하는 펩타이드를 검출할수 있습니다. 이것을 이용하여 System suitability를 수행할수 있습니다 아래는 PRM을 통해 검출가능한 대표적인 BSA peptides 리스트입니다. 아래는 100ng Pierce HeLa standad digest와 1ug Promega HeLa digestion에 대한 PRM 결과입니다. 위의 BSA 펩타이드가 아주 잘 검출되었습니다. HeLa lysate에서 BSA 펩타이드를 검출할 경우.. 2021. 7. 11. FAIMS를 이용하여 선택적으로 N-linked glycopeptides 검출하는 방법 펩타이드 분석에 있어서 FAIMS의 큰 장점중 하나는 CV값에 따라 선택적으로 펩타이드를 검출할수 있다는것입니다. 특히 서로 다른 Charge state를 가지는 펩타이드가 FAIMS에서 분리가 된다는 것입니다. 그 효율성을 테스트해보기 위해서 일반 펩타이드의 형태가 아닌 charge state가 높은 glycopeptide를 선택적으로 검출해보았습니다. 이전에 글에서 많이 사용한 haptoglobin 을 사용하였습니다. 관련글] 수작업으로 N-linked glycopeptides 구조분석하기 Haptoglobin은 전형적인 N-linked glycoprotein이며 tryptic digestion후 많은 N-linked glycopeptide들이 생성됩니다. 아래는 no FAIMS, FAIMS off,.. 2021. 7. 5. FAIMS를 이용한 분석에서 Exploris 480의 Easy-IC source를 이용한 Internal Calibration FAIMS을 이용한 분석에서는 일반적으로 보이는 background peak들이 보이지 않습니다. Single charge를 가지는 피크들이 FAIMS를 통과하면서 제거되기 때문입니다. 이러한 이유로 일반적으로 Internal calibration 시 lock mass로 사용하는 대표적인 background peak들이 검출이 되지 않습니다. 만약 이것이 문제가 된다면 지속적으로 internal calibrant가 주입되는 Easy-IC source를 이용하면 좋을것 같습니다. 그래서 FAIMS 분석에서 기존의 lock mass 방법과 Easy-IC 방법을 이용한 internal calibration의 차이를 보고자 하였습니다. 일반적으로 질량분석기가 Mass calibration이 되어 있으면 inte.. 2021. 7. 5. FAIMS가 장착된 Exploris 480에서 Cycle time (s), LC gradient와 CV값 에 따른 단백질 검출수 FAIMS가 없는 경우 일반적으로 DDA 분석에서 cycle time을 2s 혹은 3s로 설정합니다. 하지만 FAIMS에서 두 개의 CV값으로 분석하기 위해서는 cycle time을 나누어서 설정합니다. 즉 FAIMS가 없는 상태에서 3s cycle time을 사용하였다면 FAIMS에서 두개의 CV 값은 각각 1.5s로 하는것이 좋습니다. 그리고 CV값에 따라 통과되는 이온들의 수가 다릅니다. 보통 -70 은 -50 보다 더 적은 수의 이온을 통과시킵니다. 그러므로 -70 에서는 조금 더 적은 cycle time을 설정합니다. 즉 총 3s cycle time 를 사용시 -50V에서 1.7s, -70V에서 1.3s 사용하면 됩니다. Difference cycle time per CV 먼저 두개의 CV 값에.. 2021. 7. 3. Exploris 480 장비에서 Easy-IC를 이용한 internal calibration의 효율성 측정되는 펩타이드이 m/z값의 accuracy를 높이기 위해서 Acquisition 과정에서 Lock mass 방법을 사용합니다. Background 에서 항상 등장하는 대표적인 피크인 Polysiloxane 의 여러 형태인 m/z 371.101236 와 m/z 445.12003 를 사용합니다. 선택한 m/z에 따라 질량분석기는 이 피크를 선택적으로 m/z값을 선택하여 측정한후 전체 스펙트럼의 m/z값을 보정합니다. 이 방법을 사용하면 장비의 accuracy가 떨어지더라도 10ppm 이내로 보정이 가능합니다. 또한 실시간으로 스캔하여 측정하는데 소요되는 시간은 아무 미비하여 펩타이드를 분석하는데 거의 영향을 주지 않습니다. 하지만 이 두 피크는 LC gradient에 따라 감도가 다르고 종종 backgr.. 2021. 7. 2. 이전 1 ··· 30 31 32 33 34 35 36 ··· 61 다음
