프로테오믹스(단백체학)358 P-2000 Laser-Based Micropipette Puller 로 Nano column 만들기 대형회사가 아니면 보통 실험실에서는 컬럼을 만들어 사용한다. 처음 일을 시작할때 실험실에 Laser puller가 있었는데 아무도 사용하지 않고 있어서 조금 의아해 했다. 다른 휴대용 가스토치로 직접 만들어 사용하고 있었다. Vanderbilt University에 있었을때 이 laser puller를 사용했기에 그냥 쉽게 사용할 수 있었다. https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html Laser puller로 만든 컬럼이라도 항상 좋은 피크모양을 보장하지 않는다. 특히 C18을 충진하는 과정에서 비일괄적으로 충진되는 경우가 종종 있다. 그래서 같은 protocol을 사용하더라도 충진되는 시간도 다르고 LC에 연결했을때 backpressure도 다르다. 보통 사용.. 2020. 4. 6. Trap-column 상태확인하는 방법 (Checking efficiency of trap-columns) Nano analytical column은 보통 실험실에서 in-house 형태로 만들어 사용하지만 상황에 따라서는 미리 만들어진 Trap-column을 구매해서 사용하는 경우도 많습니다. 실험실에서 만들어 쓰는 trap-column의 경우는 주기적으로 교체하면 됩니다. 하지만 주문하여 구입한 trap-column은 고가임으로 쉽게 버리지 못합니다. 최대한 많이 사용하되 컬럼교체 시기를 제대로 알수 있다면 컬럼 이상에 의한 실험이 잘못되는 것을 예방할 수 있습니다. Analytical column에 비해서 Trap-column은 피크모양에 상대적으로 적은 영향을 미칩니다. 그래서 피크모양으로 trap-column의 상태를 판단하기는 어렵습니다. 하하지만 Trap-column의 상태가 좋지 않으면 bind.. 2020. 4. 5. Promega사의 rAsp-N(P/N VA116A)의 사용후기 및 적용방법 rASp-N을 이용하여 Sequence coverage 증가시키기 2018년 ASMS ( San Diego, California) 에서 우연히 Promega사의 Poster를 보았습니다. 새로나온 rAsp-N enzyme를 소개하는 내용이었습니다. Asp-N digestion: Hydrolyzes Peptide Bonds on the N-Terminal Side of Aspartic and Cysteic Acid Residues (Asp and Cys) 종종 분석의뢰자가 분석하고자 하는 단백질의 sequence에 K, R 이 적절하게 존재하지 않아서 trypsin으로 충분한 정보를 얻지 못할때가 있습니다. 보통 Trypsin 대용으로 Gluc 혹은 Chymotrypsin을 사용하여 왔는데 이 rAsp-N.. 2020. 4. 5. 데이타베이스 검색조건에서 Enzyme의 Semi 옵션으로 N-terminal 펩타이드 검출하는 법 Part1에서 소개한것에 이어 "Semi" 검색은 단일 단백질에서 추가적은 PTM sites를 찾는데도 유용하다. 간단히 acetylated BSA (Sigma-Aldrich, B2518)로 테스트해보았다 Sample: 250ng Acetylated BSA (on-column) Instrument: UltiMate™ 3000 RSLC coupled to Q-Exactive HFX DB search: Proteome Discoverer 2.3 아래는 Trypsin Full 와 Semi 로 각각 검색했을때의 결과이다. 결과에서 보는것과 같이 "Semi"에서 더 높은 sequence coverage 보였다. 아래의 노란색 부분은 "semi"에서만 검출된 sequence 영역이다. 아래 그림은 trypsin F.. 2020. 4. 5. 데이타베이스 검색조건에서 Enzyme의 Full 과 Semi 의 차이 알아보기 질량분석기를 통해 얻은 raw 파일은 데이타베이스를 통해 단백질을 동정합니다. 이때 데이타베이스 프로그램의 파라미터중 enzyme 부분이 "Full" 이 Default 값으로 정해져 있습니다. 이것은 해당 enzyme이 단백질을 이론적으로 절단할 수 있는 아미노산 사이트만 고려하여 검색하는 것입니다. 하지만 실제 Digestion중에서는 우리가 생각하지 못하는 일들이 일어납니다. 불안전한 digestion 혹은 필요이상으로 incubation 시켰을때도 이론적인 경향에서 벗어나는 경우도 있습니다. 이러한 이유로 종종 "Full"이 아닌 "Semi"로 변경하게 되면 "Full"에서는 발견되지 않은 펩타이드들이 종종 발견됩니다. 이 방법은 정제가 잘된 단일단백질에 적용이 잘됩니다. SDS-PAGE 에서 아주.. 2020. 4. 5. Morpheus (Free, Simple, Fast search tool) 사용법 알아보기 실험장비에서 LC-MS/MS 장비 QC 용으로 사용할 간단한 검색프로그램설치하기 다른 글에서 이야기 했듯이 대부분 실험실에서 분석을 시작하기 전에 Standard mixture (e.g, BSA)로 장비상태를 확인합니다. 이때 데이타베이스 검색프로그램을 이용합니다. 하지만 데이타베이스용 컴퓨터는 장비 운용 컴퓨터와 분리되어 있거나 다른 사람들과 공용으로 사용합니다. 그래서 데이타 생성후 바로 검색하기가 어려울때가 있습니다. 매번 파일을 옮기는것도 귀찮습니다. 이때 장비용 컴퓨터에 설치하여 바로 검색할 수 있는 적은용량의 툴이 있으면 좋겠다고 생각했습니다. Morpheus 는 적은 용량의 프로그램이라 실험장비에 설치해도 장비운영에 아무런 영향을 주지 않습니다. BSA raw 파일을 드래그후 검색하는데 30.. 2020. 4. 5. 이전 1 ··· 56 57 58 59 60 다음
