프로테오믹스(단백체학)358 단일 In-gel 밴드에서 99% Sequence coverage 얻기 얼마전에 분석의뢰자의 단일 단백질(~MW 100kDa) 에 해당하는 In-Gel band로 부터 99.04% sequence coverage를 얻었다. 총 778 펩타드가 검출되었다. (modified forms 과 mis-cleavage form 포함) 최근에 분석한 gel-band 중에서 가장 높은 Sequence coverage가 나온것 같다. 아래그림은 Base-peak chromatogram (왼쪽)과 Proteome discoverer(오른쪽, 약간 흐리게 처리) 에서 검색된 화면이다 잘 정제된 단백질과 충분한 양의 시료가 있으면 거의 100%에 가까운 sequence coverage를 보여줄 수 있음을 확인했다. 물론 단백질의 Sequence 조합도 중요한 요소가 되었으 것이다. 2020. 4. 16. Promega 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 를 이용한 시스템 QC 시스템 QC 용으로 Promega사의 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 를 구매하여 테스트 하였다. 일반적으로 System Suitability 체크용 Standard 펩타이드의 경우 서로 동일한 농도를 가지는 서로 다른 펩타이드 의 Mixture이다. 혹은 일련의 서로 다른 농도를 가지는 서로 다른 펩타이드의 경우도 마찬가지이다 그러나 Promega 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 는 6가지의 서로 다른 펩타이드를 가지며 동일한 펩타이드에 5가지 서로다른 농도의 heavy isotope이 포함되어 있다.. 즉 한번의 시료 주입으로 LC 시스템, 컬럼상태, 질량분석기의 Sensitivity와 Dynamic range 동시에 체크가 가능하다.. 2020. 4. 15. Active Background Ion Reduction Device (ABIRD)를 이용한 Background Peaks의 감소 측정 일을 시작하고 얼마후 질량분석기실에 아래 장비가 있는 걸 발견했다. 검색해서 찾아보니 ESI Source Solution LLC 사의(바로가기) ABIRD (An Active Background Ion Reduction Device, 바로가기)라는 장비였다. Nano spay ESI에서의 background를 현저히 감소시키는 장비로써 N2 가스등이 필요가 없는 아주 간단한 장비이다. Signal-to-noise 를 증가시켜 검출감도를 높이는것이라 생각된다. Air가 나오는 호스부분을 Spray tip 근처에 두고 스위치만 켜면 되다. (ESI Source 주위에 공간이 적어서 이 장비를 세워두는게 약간 불편했. 또한 Air가 나오는 부분의 호스의 끝부분을 Spray tip 근처로 두는것도 약간 불편했다.. 2020. 4. 14. Proteome Discoverer 2.4 의 Precursor Detector note를 이용한 단백질 검출 향상법 최근에 Proteome Discoverer 2.3을 2.4로 무료 업그레이드 하였다. 전체적으로 2.3과 크게 다르지 않은것 같다. 하지만 눈에 띄는것이 Precursor Detector node 이다. 인터넷 검색으로 찾아본 봐로는 아래와 같은 특성이 있다고 한다. Spectrum Selector by default chooses isotopic cluster selected by instrument • Precursor Detector node • Detects other isotopic clusters with peaks within the precursor isolation window • Duplicates MS/MS spectrum for each new precursor mass • Only.. 2020. 4. 13. Thermo TSQ Altis™ Triple Quadrupole 를 이용한 프로테오믹스 분석 2018년에 microflow Vanquish UPLC + Thermo TSQ Altis™ Triple Quadrupole 를 설치하였다. 사실 나는 MRM 분석이 주 분야가 아니다. 하지만 설치된후 특별히 테스트 할 사람이 없어서 내가 직접 몇가지 테스트를 진행했다. 1) Q1 Full scan with 2 µg HeLa digest 먼저 대략적인 감도를 측정해보기 위해 2 µg HeLa digest를 Q1 full scan으로 분석해 보았다. 아래는 MS1 Full scan chromatogram이다. 2 µg정도의 양으로 충분한 감도가 나온다는것을 확인하였다. 보통 nano LC system를 이용한 DDA 혹은 PRM 분석에서도 1~ 2 µg정도의 양이 사용되는것을 감안하면 Triple Quadr.. 2020. 4. 12. Spike-in Proteins for quantitative proteomics (Ovalbumin) Human species 시료에 대한 Spike-in Ovalbumin Spike-in 단백질은 분석할 시료의 수가 많은 정량분석에서 유용하게 사용됩니다. 각각의 시료 전처리에 대한 재현성 여부, 각 시료분석 과정에서의 이상여부 확인, 분석후 통계처리시 표준화 (normalization)등에 사용할수 있습니다. 최근 PRM 혹은 DIA등을 이용한 대량의 정량분석법이 널리 이용됨에 따라 정량분석의 정확도 여부가 중요한 요소가 되고 있습니다. 분석의뢰자의 시료의 종은 대부분의 인간유래 종 (Homo Sapiens) 입니다. 그래서 Human 시료에 spiking 할수 있는 적절한 단백질을 찾아 테스트 해보았습니다. 아래 단백질은 대표적으로 human samples에 사용될수 있는 spike-in 단백질입니다.. 2020. 4. 11. 이전 1 ··· 54 55 56 57 58 59 60 다음
