전체 글516 데이타베이스 검색조건에서 Enzyme의 Full 과 Semi 의 차이 알아보기 질량분석기를 통해 얻은 raw 파일은 데이타베이스를 통해 단백질을 동정합니다. 이때 데이타베이스 프로그램의 파라미터중 enzyme 부분이 "Full" 이 Default 값으로 정해져 있습니다. 이것은 해당 enzyme이 단백질을 이론적으로 절단할 수 있는 아미노산 사이트만 고려하여 검색하는 것입니다. 하지만 실제 Digestion중에서는 우리가 생각하지 못하는 일들이 일어납니다. 불안전한 digestion 혹은 필요이상으로 incubation 시켰을때도 이론적인 경향에서 벗어나는 경우도 있습니다. 이러한 이유로 종종 "Full"이 아닌 "Semi"로 변경하게 되면 "Full"에서는 발견되지 않은 펩타이드들이 종종 발견됩니다. 이 방법은 정제가 잘된 단일단백질에 적용이 잘됩니다. SDS-PAGE 에서 아주.. 2020. 4. 5. Morpheus (Free, Simple, Fast search tool) 사용법 알아보기 실험장비에서 LC-MS/MS 장비 QC 용으로 사용할 간단한 검색프로그램설치하기 다른 글에서 이야기 했듯이 대부분 실험실에서 분석을 시작하기 전에 Standard mixture (e.g, BSA)로 장비상태를 확인합니다. 이때 데이타베이스 검색프로그램을 이용합니다. 하지만 데이타베이스용 컴퓨터는 장비 운용 컴퓨터와 분리되어 있거나 다른 사람들과 공용으로 사용합니다. 그래서 데이타 생성후 바로 검색하기가 어려울때가 있습니다. 매번 파일을 옮기는것도 귀찮습니다. 이때 장비용 컴퓨터에 설치하여 바로 검색할 수 있는 적은용량의 툴이 있으면 좋겠다고 생각했습니다. Morpheus 는 적은 용량의 프로그램이라 실험장비에 설치해도 장비운영에 아무런 영향을 주지 않습니다. BSA raw 파일을 드래그후 검색하는데 30.. 2020. 4. 5. Standard BSA digest 로 LC 장비, 컬럼, 질량분석기 상태확인는 법 간단한 방법으로 장비상태를 확인하여 최적의 장비상태를 유지하기 항상 최적의 장비상태로 분석을 하면 얼마나 좋을까 생각합니다. 하지만 어쩔수 없이 일정 시간이 지나면 장비의 감도는 떨어지게 마련이며 그때 마다 장비를 분해해서 클리닝을 할 수도 없습니다. 이러한 상황에서 실험을 하다 보면 장비의 감도가 얼마나 되는지 모르는 상태에서 분석을 하게 됩니다. 실험이 끝난후에야 알게 되면 더욱 난처합니다. 결과가 좋지 않아서 시료의 탓을 하게 되는 경우도 있습니다. 이러한 이유로 장비의 상태를 매일 확인하는것은 귀찮은 일이지만 필수적인 업무입니다. 실험실마다 장비의 상태를 체크하는 방법이 있을것입니다. 그중에 Standard BSA (New England BioLabs, P8108S)를 이용하여 매일의 장비 (na.. 2020. 4. 5. LC Gradient 길이에 따라 검출되는 단백질의 수는 얼마나 차이가 나는가? "LC Gradient를 증가시키면 얼마만큼의 단백질을 더 검출할수 있을까?" 분석의뢰자로부터 자주 듣는 질문중 하나는 " 몇개의 단백질이 검출되느냐" 입니다. 네이쳐나 기타 좋은 논문에서 봤던 엄청난 수의 단백질을 사뭇 기대하고 묻는 질문일 경우가 많습니다. 하지만 검출될수 있는 수는 sample type, complexity 등에 따라 천차만별입니다. 검출되는 단백질의 수는 다른 모든 조건이 동일하다면 특정 시간에 LC에서 용리된 펩타이드들이 질량분석기에서 얼마나 많이 측정될수 있는가에 많이 의존합니다. 물론 질량분석기의 감도가 좋거나 아주 최적화된 조건에서는 더 많이 검출하지만 질량분석기를 매번 바꿀수도 없고 조건도 매번 바꾸지 않습니다. 그래서 LC gradient 시간을 증가시키면 검출되는 펩타.. 2020. 4. 4. 질량분석기로 단백질-단백질 상호작용 검출 (Protein-Protein interaction analysis)하기 질량분석기는 아마 특정 단백질에 상호작용하여 결합하는 단백질을 찾아내는데 있어서 가장 적합한 장비일것입니다. 최근의 질량분석기는 높은 감도와 검출속도의 덕분에 이전에 비해 훨등히 많은 단백질을 검출해 낼 수 있습니다. 하지만 이 단백질-단백질 상호작용의 분석 실험에서 주의 해야할 사항인 비특이적( Non-specific bound proteins)으로 결합하는 단백질을 최소화 하는것입니다. 이것은 질량분석기로 검출하기전 실험단계 즉 IP/Pull-down 과정에서 이루어 져야합니다. 하지만 이러한 비특이적인 결합은 완전이 제외시킬수는 없습니다. 즉 질량분석기로 분석을 하여 얻은 단백질에는 이러한 비특이적인 단백질이 포함되어 있기 마련입니다. 종종 질량분석기에서 검출된 모든 단백질을 특이적 단백질이라 생각.. 2020. 4. 3. Immunoprecipitation 이후 질량분석을 위한 시료 전처리 방법 (Sample preparation of IP elution for MS analysis) IP이후 단백질 분석을 위해서는 얼마만큼의 양이 필요한가? (Co)-Immunoprecipitation (IP) 혹은 Pull-down 이후 질량분기를 통한 단백질 분석은 특정 단백질을 검출하는 방법중 가장 감도가 높은것중에 하나입니다. 이 실험의 성공여부는 질량분석전 특정 단백질을 얼마나 순수하게 잘 정제하느냐가 관건입니다. 이 부분은 IP/Pull-down을 수행하는 사람이 최적화를 할 수 밖에 없습니다. 이 이후 질량분석기로 분석하기 전에 가장 많이 받는 질문이 " 필요한 양" 입니다. 간단히 말하자면 "많을 수록 좋다(The more, the better)" 입니다. 하지만 의뢰자는 보다 정확하게 알기를 원합니다. 그러나 IP 수행후 Elution buffer 안의 단백질 양을 정확히 알기가 어렵.. 2020. 4. 2. 이전 1 ··· 83 84 85 86 다음
