최근에 각광받고 있는 EncyclopeDIA 방식의 DIA 분석법을 테스트 해보았습니다. 두 논문에서 주도적으로 실험을 주도한 Lindsay 박사가 저희 센타 Director 의 랩에 최근에 Postdoc로 들어와서 도움을 많이 받게 되었습니다. 이 방식은 기존에 널리 사용된 방법인 펩타이드를 분획후 DDA 방식으로 얻은 데이타를 Spectra library 로 사용하는 방식과는 다른 방식을 사용합니다
관련 논문은 아래와 같습니다.
- Searle BC, Pino LK, Egertson JD, et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 2018;9(1):5128. Published 2018 Dec 3. doi:10.1038/s41467-018-07454-w
- Pino LK, Just SC, MacCoss MJ, Searle BC. Acquiring and Analyzing Data Independent Acquisition Proteomics Experiments without Spectrum Libraries. Mol Cell Proteomics. 2020;19(7):1088-1103. doi:10.1074/mcp.P119.001913
Spectra library를 만들기 위해서 시료를 분획하지 않고 Gas-Phase fractionation (GPF) 방법을 사용합니다. 즉 pooling 한 시료를 분획하지 않고 여러번 질량분석기로 분석하여 Spectra library를 생성합니다. 이때 사용되는 방법이 GPF방법입니다. 즉 m/z 400-1000 사이를 6개로 나누어서 (400-500, 500-600, 600-700, 700-800-800-900,900-1000) DIA 를 수행하여 Spectra library를 얻습니다. 이때 overlap 방식의 DIA를 사용합니다. 최종적으로 실제 정량분석한 시료를 개별적으로 DIA 분석을 수행합니다. 이때도 물론 Overalp 방식의 DIA 를 사용합니다. 자세한 분석법은 두 논문에 아주 자세히 잘 나와있습니다.
논문에 나온 방식을 이용하여 직접 분석해보았습니다.
HeLa standard digest를 사용하여 GPF 방식으로 spectra library 생성을 위한 파일을 만들었고 실제 분석을 위해서 5번 반복 실험을 하였습니다.
보통 120분 이상의 분석시간이 적절하지만 테스트를 위해서 60분을 사용하였습니다.
DIA 분석을 위한 파일 생성
1.GPF분석 Method 설정
Xcalibur에서의 Q-Exactive method 입니다. GPF 분석을 위한 Method에서 DIA 부분은 동일합니다. 단 Full MS 에서 Scan range를 각각 395-505, 495-605, 595-705, 695-805, 795-905, 895-1005을 사용합니다. GPF 분석을 위해서는 각 method에서는 4.0 m/z isolation window를 사용합니다. 이것은 장비마다 다르며 Q-Exactive 의 경우 4.0 m/z가 적당합니다.
그리고 각 Full scan range 에 맞는 inclusion list를 삽입합니다. 아래는 각각의 inclusion list 파일입니다.
2. GPF 분석
생성된 method로 시료를 분석하면 됩니다. 컬럼의 capacity에 따라 시료양을 적절이 정하면 됩니다. Standard digest가 아닌 경우 보통 2~3 ug정도면 좋습니다. 아래는 GPF 로 얻어진 500 ng HeLa standard digestion 6개의 크로마토그램입니다. Full scan 의 영역이 다르기 때문에 크로마토그램의 모양도 조금씩 다릅니다.
3, DIA 정량분석
DIA 정량분석을 위한 Q-Exactive의 파라미터입니다. 여기서의 파마미터는 Q-Exactive 에 최적화 된것이며 QE-HF나 QE-HFX 경우 달라질수 있습니다. 24 m/z isolatin 을 사용하였습니다.
DIA에 사용된 inclusion listd입니다.
아래는 정량분석을 위해 500ng HeLa standard digest을 5번 반복 분석한 크로마토그램입니다.
여기까지는 DIA 정량분석을 위한 파일이 모두 생성되었습니다.
이제 EncyclopeDIA 프로그램을 이용하여 정량분석을 수행합니다.
EncyclopeDIA를 이용한 데이타베이스 검색
1.EncyclopeDIA 설치
https://bitbucket.org/searleb/encyclopedia/wiki/Home
간단히 다운로드 받아서 설치하면 됩니다.
다운로드 받은 파일이 실행파일이 됩니다. 다운로드 받은후 따로 설치과정이 필요없습니다.
2.mzML 파일 변환
파일변환에 사용되는 tool을 다운로드 합니다.
http://proteowizard.sourceforge.net/
EncyclopeDIA 로 분석을 하기 위해서는 모든 파일은 mzML 파일로 변환해야됩니다.
Overlap DIA 파일이기으로 아래와 같은 변환 옵션이 필요합니다.
Filters에서 Peak Picking 과 Demultiplex 순으로 옵션을 선택하여 Add를 누릅니다. 최종적으로 아래 오른쪽에 보이는 화면에 나오는것과 같이 셋팅을 합니다.
DIA로 분석한 모든 파일을 넣고 한꺼번에 모두 mzML로 변환합니다. 아래는 진행되고 있는 화면입니다.
3.EncyclopeDIA의 Walnut을 이용한 Spectra library 생성
EncyclopeDIA 아이콘을 클릭합니다. 화면에서 두개의 Tab 이 보입니다(EncyclopeDIA & Walnut) . Walnut은 spectra library 를 생성하며 EncyclopDIA 로 생성된 spectra library를 이용하여 실제 DIA 정량분석을 합니다.
Walnut으로 이동합니다. Background 와 target sequence가 따로 구별되지 않으면 (대부분의 경우임), 분석에 사용될 species의 fasta 파일을 두 곳 모두에서 업로드 합니다. 나머지 파라미터는 바꾸지 않았습니다.
화면에서 오른쪽에 "Add MZML" 아이콘이 있습니다. 여기서 GPF로 분석한 6개 파일에 해당하는 mzML파일을 업로드 합니다. 업로드 하지마자 마로 진행이 됩니다. 진행이 모두 끝나면 아래 화면 처럼 모두 초록색으로 바뀝니다.
이제 Spectra library로 변환을 해야 합니다. "Save Chromatogram Library"을 클릭하여 저장할 폴더와 파일이름을 씁니다. "Save"를 누르면 바로 진행이 됩니다. 즉 6개의 파일에서 얻어진 스펙트라를 이용하여 한개의 Spectra library를 생성합니다.
진행이 끝나면 아래와 같이 보입니다.
4. EncyclopeDIA를 이용한 정량분석
프로그램을 닫고 다시 오픈합니다. (메뉴얼에 프로그램을 닫고 다시 오픈하라고 적혀있습니다. 이제 EncyclopeDIA 탭으로 이동합니다. Library에 조금전 Walnut에서 생성한 library 파일을 업로드 합니다. background 에는 조금전 사용했던 fasta 파일을 업로드 합니다. "Add MZML"을 클릭하여 정량분석하고자 하는 DIA 파일에 해당하는 mzML파일을 모두 클릭합니다. 업로드와 동시에 바로 진행이 됩니다.
아래와 같이 진행이 완료되었습니다.
이제 얻어진 결과를 excel등으로 볼수 있도록 export를 시켜야 합니다.
"Save Quant Reports"를 클릭하고 저장할 폴더와 이름을 적습니다. 아래와 같이 완료되었습니다.
확장자.elib로 생성되었습니다.
동일한 이름으로 peptide와 protein group파일이 생성되었습니다. . 이 두 text 파일이 최종정량분석된 파일입니다.
엑셀로 불러오면 아래와 같이 보입니다.
단백질 이름, 검출된 펩타이드수, 펩타이드 종류, 그리고 각 시료별 단백질의 정량값이 보입니다. 펩타이드 그룹도 마찬가로 보입니다.
이렇게 하여 EncyclopeDIA DIA 분석법을 설명하였습니다. 다음글에는 동일한 시료를 이용하여 EncyclopeDIA, 기존의 DIA 분석법, 그리고 DDA 분석법과의 비교 결과를 설명해보겠습니다.
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